雷帕霉素通過(guò)Ets1促進(jìn)Foxp3穩(wěn)定表達(dá)的研究.pdf

1、分類號(hào)：R3929密級(jí)：內(nèi)部2年學(xué)位類別：科學(xué)學(xué)位團(tuán)專業(yè)學(xué)位口學(xué)校代碼：10062學(xué)號(hào)：20092048學(xué)科門類：醫(yī)學(xué)夭肄醬斜文等TlANJIN黼鍪O|‘滿毛堪麓I媛囂渤1髻碩士學(xué)位論文MASTER’SDISSERTATION論文題目：雷帕霉素通過(guò)Etsl促進(jìn)Foxp3穩(wěn)定表達(dá)的研究TITLERapamycinenhacethestabilizedexpressionofFoxp3viaEtsl一級(jí)學(xué)科：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科：免疫學(xué)論文作者

2、：趙輝指導(dǎo)教師：姚智教授天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二。一二年五月天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要目的使用RAPA／TGF6誘導(dǎo)CD4Foxp3。T細(xì)胞表達(dá)Foxp3蛋白，使其轉(zhuǎn)化為iTreg細(xì)胞，檢測(cè)Foxp3基因組相關(guān)DNA區(qū)域的甲基化狀態(tài)，進(jìn)一步檢測(cè)甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化相關(guān)蛋白的變化，初步探討RAPA發(fā)揮作用的可能機(jī)制。方法I磁珠分離與流式分選法獲取Foxp3GFPBALB／C轉(zhuǎn)基因鼠CD4Foxp3‘T細(xì)胞，以RAPA／TGFD共同誘

3、導(dǎo)CD4Foxp3。T細(xì)胞表達(dá)Foxp3蛋白，轉(zhuǎn)化為iTreg細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)iTreg細(xì)胞的誘導(dǎo)效率和Foxp3蛋白表達(dá)穩(wěn)定性。2流式分選iTreg細(xì)胞，提取基因組DNA，經(jīng)重亞硫酸鹽處理后，用甲基化特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將特異的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到TA克隆載體，轉(zhuǎn)化入DH5a大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行基因測(cè)序，以檢測(cè)Foxp3基因相關(guān)DNA區(qū)域的甲基化狀態(tài)。3應(yīng)用RealTimePCR和WesternBlot技術(shù)檢測(cè)iTreg細(xì)胞

4、的DNMT1、DNMT3a和DNMT3b等甲基化酶以及Etsl和TDG等去甲基化相關(guān)蛋白的改變。結(jié)果1TGFp可以誘導(dǎo)CD4Foxp3’T細(xì)胞表達(dá)Foxp3蛋白，使其轉(zhuǎn)化為iTreg，其中10ng／ml誘導(dǎo)至第3天效率最高，F(xiàn)oxp3陽(yáng)性率可達(dá)177％，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)oxp3陽(yáng)性率逐漸降低，至第10天，僅有不到10％。這表明TGFp誘導(dǎo)產(chǎn)生的iTreg細(xì)胞不能穩(wěn)定表達(dá)Foxp3蛋白。RAPA／TGF13可明顯促進(jìn)Foxp3蛋白的表達(dá)，

5、與TGFp誘導(dǎo)法相比，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)效率均顯著提高(P005)。其中，RAPA／TGFp在第7天的誘導(dǎo)效率最高，可達(dá)309％。從第5天至第10天，RAPA／TGF—p誘導(dǎo)iTreg產(chǎn)率相對(duì)穩(wěn)定，均高于20％，直到第10天仍有265％表達(dá)率，表明RAPA／TGFB可以使Foxp3蛋白相對(duì)穩(wěn)定表達(dá)。2測(cè)序結(jié)果顯示，E1BSP和E2BSP引物對(duì)應(yīng)基因組DNA區(qū)域各組細(xì)胞均為去甲基化狀態(tài)。TSDRBSP引物對(duì)應(yīng)基因組DNA區(qū)域存在6個(gè)CpG位點(diǎn)