重癥手足口病預(yù)警指標(biāo)及其病原特征和細(xì)胞疾病模型初探.pdf

1、手足口病(hand-food-mouth disease，HFMD)是由小RNA病毒科腸道病毒屬引起的急性腸道傳染病，隨著對(duì)其臨床特征及致病機(jī)制研究的不斷深入可知:EV-A71引起的普通HFMD在臨床癥狀等方面與柯薩奇病毒A組16型(CoxsackievirusA16，CV-A16)及其他腸道病毒(other enterovirus，other EV)引起的HFMD難以區(qū)別，且多種腸道病毒均有重癥病例的報(bào)道。目前對(duì)于重癥病例的治療以對(duì)癥

2、治療為主，且尚無(wú)特效的抗病毒藥物及安全有效的疫苗可應(yīng)用于人群。因此，HFMD的預(yù)防控制策略重心主要在于傳染源的控制和切斷傳播途徑。隨著人口流動(dòng)性的加大，疾病傳播速度的加快，傳統(tǒng)的流行病學(xué)危險(xiǎn)因素分析已難以實(shí)現(xiàn)對(duì)該病的完全防控，所以分析其臨床流行病學(xué)及分子遺傳進(jìn)化對(duì)該病的防控顯得尤為重要。
　　此外，對(duì)疾病的預(yù)防亦離不開(kāi)對(duì)其發(fā)病機(jī)制的探討。就目前而言，對(duì)重癥HFMD患兒發(fā)病機(jī)制的研究成效甚微。我們知道，病毒感染細(xì)胞的第一步是與受體結(jié)

3、合，而目前EV-A71究竟通過(guò)何種受體入胞尚不清楚;此外，蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展為研究病毒性疾病的發(fā)病機(jī)制、早期診斷及靶蛋白的發(fā)現(xiàn)提供了可能。
　　本研究以河南省鄭州市兒童醫(yī)院2013-2015年HFMD高發(fā)時(shí)段（4月～6月）77例重癥HFMD患兒為病例組，以同期77例輕癥HFMD患兒為對(duì)照組，對(duì)患者的臨床特征及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行分析，采用秩和檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行初步篩選，結(jié)合判別分析篩選重癥HFMD患兒的實(shí)驗(yàn)室預(yù)測(cè)指標(biāo)，為重癥HFMD

4、的早期識(shí)別、臨床干預(yù)和治療提供新的方法和指標(biāo)，為該病的防控提供科學(xué)依據(jù);在此基礎(chǔ)上，對(duì)2013年～2015年HFMD高發(fā)時(shí)段的主要病原進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析;此外，本研究篩選出EV-A71敏感神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系，在此基礎(chǔ)上研究EV-A71感染宿主免疫細(xì)胞后對(duì)Toll樣(Toll-like receptors，TLRs)受體、炎癥因子及炎癥小體相關(guān)基因、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve growth factor，NGF)及其受體相關(guān)基因表達(dá)的影響及差異蛋

5、白質(zhì)學(xué)，以期進(jìn)一步了解HFMD發(fā)生機(jī)制，為探索有效的防治措施提供依據(jù)。
　　目的：
　　1、篩選重癥HFMD的實(shí)驗(yàn)室預(yù)警指標(biāo)，為該病的早期識(shí)別和臨床干預(yù)提供依據(jù)，為機(jī)制的探討指明方向。
　　2、闡明河南地區(qū)2013-2015年HFMD流行高峰期主要病原的VP1基因特征，為我省疫情監(jiān)測(cè)和防治提供依據(jù)。
　　3、初步了解EV-A71病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞后TLRs、炎癥因子、炎癥小體、NGF及其受體相關(guān)基因的表達(dá)變化，

6、探討EV-A71可能的嗜神經(jīng)機(jī)制。
　　4、初步了解EV-A71病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞后的差異蛋白組學(xué)，為EV-A71的嗜神經(jīng)機(jī)制提供可能的蛋白靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1、研究設(shè)計(jì)、調(diào)查員培訓(xùn)及預(yù)調(diào)查;正式調(diào)查及質(zhì)量控制;統(tǒng)計(jì)分析。
　　2、糞便樣品的采集與保存;根據(jù)HFMD實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)進(jìn)行糞便樣品的處理;根據(jù)QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA;嚴(yán)格按照碩世(2+1)試劑盒進(jìn)

7、行腸道病毒熒光RT-PCR檢測(cè);用RD細(xì)胞進(jìn)行EV-A71及CV-A16病毒分離;RT-PCR擴(kuò)增EV-A71及CV-A16 VP1基因;1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行基因擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)并測(cè)序;生物信息學(xué)分析。
　　3、常規(guī)RD細(xì)胞培養(yǎng);EV-A71毒株的制備與定量;EV-A71感染U87細(xì)胞模型的建立及病變發(fā)生時(shí)間的確定;收集細(xì)胞及細(xì)胞RNA提取;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目的基因。
　　4、選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn);根據(jù)預(yù)

8、實(shí)驗(yàn)確定最佳感染時(shí)間，之后收集細(xì)胞提取蛋白;樣品濃度測(cè)定;每份樣品各取5μL，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè);蛋白預(yù)處理;蛋白樣品色譜質(zhì)譜檢測(cè)，獲得原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果：
　　1、重癥HFMD實(shí)驗(yàn)室預(yù)警指標(biāo)的篩選
　　單因素分析顯示:與輕癥組患兒相比，重癥組WBC、PLT、PCT、MCV、MCH、LCR、SCR、LCC、GLO、CK-MB、K、S100和B細(xì)胞的水平較高（P＜0.05），而重癥組MCR、EOR、BASOR

9、、SCC、MCC、EO、BASO、NA、CL、T、Th和Th/Ts的水平較低（P＜0.05）。判別分析篩選出5個(gè)重癥預(yù)測(cè)指標(biāo):MCR、LCC、Th、CK-MB和CL。逐一回代法的分類(lèi)符合率為0.799;交互驗(yàn)證的分類(lèi)符合率為0.779。
　　2、 HFMD病原基因特征
　　24株EV-A71河南分離株之間的核苷酸同源性為93.0％～100.0％，氨基酸同源性96.6％～100.0％。將此24株河南EV-A71病毒分離株VP1

10、序列與已知各基因型、基因亞型代表株進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示:24株EV-A71河南分離株與A、B1、B2、B3、B4、B5基因型代表株VP1核苷酸同源性依次為82.2％～83.8％、82.9％～84.1％、83.0％～84.3％、82.9％～84.7％、82.6％～84.0％、82.3％～83.9％;與C基因亞型C1、C2、C3、C5代表株的核苷酸同源性為88.2％～90.3％、87.5％～89.5％、86.6％～88.5％、86.1％

11、～89.6％;與C4b基因亞型核苷酸同源性為89.5％～91.5％;與C4a基因亞型核苷酸同源性為95.3％～97.9％。與CV-A16的同源性最低，僅為62.0％～63.4％;用MEGA6.0軟件對(duì)2013～2015年分離的24株EV-A71病毒VP1基因序列與取自GenBank的31株EV-A71各基因型、基因亞型代表株及1株CV-A16 G-10國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析可知，24株EV-A71河南分離株均與C4亞型代表株處于同一

12、分支，屬于C4基因亞型，2013～2015年24株EV-A71河南分離株為C4a亞群。
　　24株CV-A16河南分離株之間的核苷酸同源性為88.5％～99.6％，氨基酸同源性為98.6％～100.0％。24株河南分離株與G10國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株(U05876)的核苷酸同源性為75.4％～77.2％;與B1a代表株的核苷酸同源性為91.4％～93.8％;與B1b代表株的核苷酸同源性為88.4％～96.5％;與B1c代表株的核苷酸同源性為9

13、1.4％～93.1％;與B2代表株的核苷酸同源性為88.5％～90.6％。與EV-A71代表株的核苷酸同源性最低，僅為65.3％～66.4％。用MEGA6.0軟件對(duì)24株CV-A16河南分離株VP1基因序列與取自GenBank的12株基因型、基因亞型代表株及1株EV-A71國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析可知，24株CV-A16河南分離株分別與B1a和B1b亞型代表株處于同一分支。
　　3、 EV-A71感染U87細(xì)胞后相關(guān)基因的差異表

14、達(dá)
　　TLR1-9 mRNA的表達(dá):實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果提示:EV-A71感染后各時(shí)間點(diǎn)兩組TLR1 mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;EV-A71感染后6h TLR2 mRNA高表達(dá)(P＜0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)兩組TLR2 mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;EV-A71感染后8h TLR3 mRNA低表達(dá)(P＜0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)兩組TLR3 mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.0

15、5）;EV-A71感染后TLR6各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　炎癥小體相關(guān)基因的表達(dá):實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果提示:與對(duì)照組相比，EV-A71感染后8h及10h IL-1β升高(P＜0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;與對(duì)照組相比，EV-A71感染后8h及10h NLRP3升高（P＜0.05），其余時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　炎癥因子相關(guān)基因的表達(dá):實(shí)時(shí)熒光定

16、量RT-PCR結(jié)果提示:EV-A71感染后6h、8h、10h IL-6 mRNA均高于對(duì)照組（P＜0.05），呈時(shí)間依賴(lài)性;EV-A71感染后6h、8h、10h IL-8 mRNA均高于對(duì)照組（P＜0.05），亦呈時(shí)間依賴(lài)性。
　　NGF及其相關(guān)受體基因的表達(dá):實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果提示:EV-A71感染后2～6h NGF mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，之后兩組表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并呈現(xiàn)時(shí)

17、間依賴(lài)性，提示在EV-A71感染后期NGFmRNA表達(dá)量下降。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)在各時(shí)間點(diǎn)兩組表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);低親和力受體p75NTR在EV-A71感染后8h mRNA的表達(dá)達(dá)高峰(P＜0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)兩組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;而高親和力受體TrkA mRNA有時(shí)檢測(cè)不到，而檢測(cè)到的部分熒光Ct值達(dá)40以上，提示

18、TrkA在EV-A71感染后可能被抑制。
　　4、EV-A71感染U87細(xì)胞后相關(guān)蛋白的差異表達(dá)
　　EV-A71感染組與對(duì)照組相比，共鑒定出差異蛋白31個(gè)，其中上調(diào)蛋白9個(gè)(PIAS1、MRC2、TNPO2、PMM2、ZNFX1、APPL2、EDF1、RPA1、MYO5A),下調(diào)蛋白22個(gè)(NUDT21、PDCD6、CDKN1A、TRIM41、MRPL18、PRKCSH、KPNA6、ASL、RPL35、RBM42、UACA

19、、ABHD10、AXL、S100A10、XRN1、NAPG、GORASP2、UTP6、SUCLG1、EIF3M、SYAP1、AP3D1)。對(duì)31種差異表達(dá)蛋白的GO注釋分析結(jié)果顯示:CC包括細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外基質(zhì)、膜蛋白等6種;差異表達(dá)蛋白所涉及的BP主要涉及的過(guò)程是細(xì)胞代謝;差異蛋白涉及多項(xiàng)分子功能，主要包括蛋白結(jié)合、核苷酸結(jié)合、催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性等。通過(guò)KEGG pathway通路對(duì)31個(gè)差異蛋白進(jìn)行檢索，這些蛋白共可以參與到25個(gè)

20、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，其中匹配率最高的是代謝通路和三羧酸循環(huán)等。
　　結(jié)論：
　　1、DA可用于重癥HFMD的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)篩選。
　　2、2013～2015年河南省HFMD高發(fā)期所流行的EV-A71毒株均屬C4a亞型;所流行的CV-A16毒株以B1b基因亞型為主，輔以B1a基因亞型。
　　3、 TLR2/TLR3可能在EV-A71感染后的免疫應(yīng)答中起重要作用;IL-6、IL-8及炎癥小體可能參與EV-A71感染后的神經(jīng)免