PKC調(diào)控NMDAR在鋁致大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：通過急性側(cè)腦室和亞慢性腹腔注射染鋁，探討PKC調(diào)控NMDAR在鋁對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.急性側(cè)腦室染毒
　　(1)動(dòng)物的分組及處理：①大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，即手術(shù)對(duì)照組、生理鹽水組、4mmol/L Al(mal)3組、16mmol/L Al(mal)3組、64mmol/LAl(mal)3組，每組10只。手術(shù)組不采取處理措施，生理鹽水組組、低、中和

2、高劑量組分別側(cè)腦室給藥5μl，并在5分鐘之內(nèi)勻速緩慢注入，染毒七天，建立急性染鋁模型；②大鼠隨機(jī)分為5組，即手術(shù)對(duì)照組、生理鹽水組、PMA組、染鋁組（64mmol/L Al(mal)3組）、PMA+染鋁組，每組10只。生理鹽水組、PMA組、染鋁組、PMA+染鋁組分別注射5μl生理鹽水、PMA、64mmol/L Al(mal)3和PMA+Al(mal)3，染毒七天，研究PKC在鋁致大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的作用。
　　(2)大鼠染毒結(jié)束后

3、Morris水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，分為定位航行實(shí)驗(yàn)（學(xué)習(xí)能力）和空間探索實(shí)驗(yàn)（記憶能力）；曠場(chǎng)檢測(cè)大鼠對(duì)陌生環(huán)境的適應(yīng)能力。
　　(3)免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè)大鼠海馬組織中PKC、NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、CaMKII、Phospho-CaMKII(Thr286)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。
　　(4)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈法（RT-PCR）檢測(cè)大鼠海馬組織 NMDAR1、NMDAR2A、

4、NMDAR2B mRNA的表達(dá)。
　　2.亞慢性腹腔注射染毒
　　(1)動(dòng)物的分組及處理：50只雄性 SD大鼠隨機(jī)分為空白組、溶劑對(duì)照組、15mmol/L Al(mal)3組、30mmol/L Al(mal)3組、60mmol/L Al(mal)3組，腹腔注射染毒2個(gè)月，空白組不做任何處理。
　　(2)免疫印跡法(Western-blot)檢測(cè)大鼠海馬組織中PKC、NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B、CaMK

5、II、Phospho-CaMKII(Thr286)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。
　　(3)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈法（RT-PCR）檢測(cè)大鼠腦組織NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.急性側(cè)腦室染毒
　　(1)Morris水迷宮檢測(cè)結(jié)果：①定位導(dǎo)航實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組大鼠的逃避潛伏期逐漸縮短，5個(gè)時(shí)點(diǎn)間逃避潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在每天的訓(xùn)練中，各組大鼠的逃避潛伏

6、期隨著染毒劑量的增加而增加，從第2天開始，各劑量組大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期比手術(shù)對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，染毒劑量與染毒時(shí)間不存在交互作用?？臻g探索實(shí)驗(yàn)顯示：高劑量組大鼠第一次穿越平臺(tái)時(shí)間比手術(shù)對(duì)照組高出68.12％，目標(biāo)象限停留時(shí)間下降了23.9%，各組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)沒有顯著性差異。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與空白組、手術(shù)組和生理鹽水組相比，高劑量組大鼠在中央格的停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，高劑量組比手術(shù)對(duì)照組高出56.5%，站立次數(shù)和修飾次數(shù)

7、分別下降了36.8%和37.9%。②與染鋁組相比，注射PKC激動(dòng)劑后，大鼠第一次穿越平臺(tái)次數(shù)降低了34.8%，目標(biāo)象限停留時(shí)間增加了26.9%。曠場(chǎng)結(jié)果顯示：與染鋁組相比，染鋁+PMA組中央格停留時(shí)間、站立次數(shù)及修飾次數(shù)之間均無(wú)明顯差異。
　　(2)免疫印跡法檢測(cè)大鼠海馬組織中PKC、CaMKII、Phospho-CaMKII(Thr286)和NMDA受體各亞基，結(jié)果顯示：①NR1、NR2B隨著染毒劑量的增加呈下降趨勢(shì)。與對(duì)照組相

8、比，高劑量組NR1和NR2B的表達(dá)量分別下降了29.9%和32.9%，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NR2A雖也呈下降趨勢(shì)，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高劑量組 PKC和Phospho- CaMKII(Thr286)的表達(dá)下降了20.9%和34.7%② PMA單獨(dú)作用并未對(duì)NMDA受體各亞基產(chǎn)生影響，但與染鋁組相比，注射PMA后NR1及NR2B的表達(dá)水平分別增加了34.9%和34.3%；注射PKC激動(dòng)劑后，PKC表達(dá)增加了15.8%，與染鋁組比較，染

9、鋁+PMA組的 PKC和Phospho-CaMKII(Thr286)蛋白表達(dá)水平可恢復(fù)23.5%和40.2%。
　　(3)基因檢測(cè)結(jié)果：①隨著染毒劑量增加，各組大鼠NR1、NR2A基因的表達(dá)水平逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與手術(shù)對(duì)照組相比，高劑量組 NR1、NR2A分別下降的48%和32%，NR2B也呈下降趨勢(shì),但無(wú)顯著性差異。
　　2.亞慢性腹腔注射染毒
　　(1)Western-blot結(jié)果顯示：隨著染毒劑量的增加

10、，NR1、NR2A、NR2B的蛋白水平呈下降趨勢(shì)，與空白對(duì)照組相比，高劑量組 NR1、NR2A、NR2B的表達(dá)分別下降22.0%、29.7%、29.8%。PKC、Phospho-CaMKII(Thr286)的蛋白表達(dá)水平隨著染毒劑量的增加逐漸降低，高劑量組比空白對(duì)照組分別下降了29.3%和31.5%.
　　(2)NR1和NR2A的基因水平下降了一半以上，NR2B的基因無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1.側(cè)腦室染鋁可以損傷

11、大鼠學(xué)習(xí)記憶，損傷程度隨著染毒劑量的增加而加重；
　　2.急性染鋁引起NMDAR2B蛋白的改變不是由于轉(zhuǎn)錄水平改變引起的，主要是由于PKC調(diào)控修飾NR2B引起的，在亞慢性腹腔染毒中進(jìn)一步得到證實(shí)；
　　3.鋁引起學(xué)習(xí)記憶損傷與NMDA受體表達(dá)改變有關(guān)，可能是由于鋁進(jìn)入腦組織后，抑制PKC的轉(zhuǎn)位與激活，影響NMDA受體通道開放及NMDAR/ CaMKII復(fù)合物的形成，從而損傷學(xué)習(xí)記憶。
　　本課題由國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)