海洋橈足類cDNA文庫構(gòu)建的新技術(shù)及PAHs脅迫下火腿偽鏢水蚤基因表達(dá)的研究.pdf

1、多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是一類環(huán)境中廣泛存在的持久性有機(jī)污染物。隨著工業(yè)、海上石油運(yùn)輸及海洋中石油開采業(yè)的迅速發(fā)展，PAHs對海洋環(huán)境造成的污染日趨嚴(yán)重，直接威脅著海洋生態(tài)系統(tǒng)的健康。海洋橈足類作為種類多、數(shù)量大、分布廣、在海洋生態(tài)系統(tǒng)中具有舉足輕重生態(tài)地位的一類海洋生物，也受到PAHs污染的直接威脅。由于橈足類具有生命周期短、個(gè)體小、對污染物敏感等特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種理想的環(huán)

2、境污染指示生物，揭示橈足類對PAHs的響應(yīng)機(jī)理對于我國海洋環(huán)境監(jiān)測和健康評價(jià)具有十分重要的意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究橈足類在分子水平上對PAHs的響應(yīng)機(jī)制，有望更加迅速、準(zhǔn)確地評價(jià)PAHs等污染的潛在威脅，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。但是由于海洋橈足類的個(gè)體小，一次性獲得轉(zhuǎn)錄組研究所需的足夠RNA比較困難，從而限制了分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用。本論文在用常規(guī)方法構(gòu)建了中國近海常見橈足類太平洋紡錘水蚤（Acartia

3、pcifica）cDNA文庫的基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)分析獲得其功能基因的5'，端共同序列(5'-commonsequence，5'-CS)，并將5'-CS成功地用于哲水蚤目其它橈足類cDNA文庫的構(gòu)建。同時(shí)，利用該序列構(gòu)建了火腿偽鏢水蚤（Pseudodiaptomus poplesia）在PAHs脅迫下的抑制性消減文庫，篩選出一批對PAHs應(yīng)答的重要功能基因。最后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究了相關(guān)功能基因在PAHs脅迫下的表達(dá)模式。

4、本研究為探索橈足類對污染物響應(yīng)的分子機(jī)制及應(yīng)用分子生物標(biāo)志物監(jiān)測海洋環(huán)境中的PAHs提供了理論依據(jù)和方法參考。主要內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)太平洋紡錘水蚤cDNA文庫構(gòu)建及5'端共同序列的獲取。利用GeneRacer法構(gòu)建了太平洋紡錘水蚤的全長cDNA文庫，并通過生物信息學(xué)分析獲得其功能基因mRNA5'端的共同序列（5'-Common Sequence，5'-CS）。
　　(2)哲水蚤目不同橈足類cDNA文庫的構(gòu)建。使用5

5、'-CS序列成功構(gòu)建了我國海洋常見橈足類（如，火腿偽鏢水蚤）的全長cDNA文庫，獲得了參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因調(diào)控、物質(zhì)和能量代謝及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等功能的基因cDNA序列。
　　(3)橈足類細(xì)胞質(zhì)核糖體蛋白基因分析。通過分析5'-CS-cDNA文庫并利用5，-CS序列進(jìn)行簡并引物克隆，獲得了火腿偽鏢水蚤全套共79種細(xì)胞質(zhì)核糖體蛋白cDNA序列（32種小亞基蛋白和47種大亞基蛋白），并分析了其核酸及氨基酸序列特征:cDNA編碼區(qū)GC含量高于非翻

6、譯區(qū)，3'-UTRs長度顯著大于5'-UTRs，具有顯著的物種密碼子偏好;推導(dǎo)的核糖體蛋白氨基酸序列中堿性氨基酸（Arg和Lys）含量最高;等電點(diǎn)較高，集中分布在10-12之間。
　　(4) PAHs（1，2-二甲基萘和芘）對火腿偽鏢水蚤的急性毒性。火腿偽鏢水蚤對PAHs較為敏感。在1，2-二甲基萘和芘暴露下，火腿偽鏢水蚤的96小時(shí)半致死濃度(96h-LC50)及95％置信區(qū)間分別為:788.98(681.93-912.82)μg

7、/L、54.68(47.88-62.45)μg/L。
　　(5)火腿偽鏢水蚤在PAHs脅迫下消減雜交文庫的構(gòu)建?；诨鹜葌午S水蚤的5'-CS序列，利用“生物素標(biāo)記-磁珠法”構(gòu)建1，2-二甲基萘和芘脅迫條件下的該橈足類全長cDNA消減文庫，首次獲得其對PAHs脅迫應(yīng)答的一系列功能基因全長cDNA序列，包括谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferasedelta-epsilon(GST(δ-ε))和Glutath

8、ione S-transferase theta(GST(θ)))、谷胱甘肽過氧化物酶(Phospholipid-hydroperoxide glutathione peroxidase(GPx4)和Glutathione peroxidase2(GPx2))、抗氧化蛋白(Peroxiredoxin6，Prdx6)、Ras-相關(guān)的C3肉毒桿菌底物蛋白1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate1，

9、Rac1）等。
　　(6)火腿偽鏢水蚤重要功能基因在亞致死濃度PAHs（1，2-二甲基萘和芘）脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式分析，研究結(jié)果如下:
　?、賀PL15和RPS20可作為1，2-二甲基萘脅迫下火腿偽鏢水蚤的參考基因已RPL15和EF-1-delta可作為芘脅迫下火腿偽鏢水蚤的參考基因。
　?、诓煌墓δ芑?，甚至屬于不同家族的同一功能基因的表達(dá)量在不同PAHs脅迫條件下表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律已從本研究中7種功能基因響應(yīng)的

10、程度和敏感性上來看，火腿偽鏢水蚤對芘的脅迫相對與1，2-二甲基萘的脅迫更為敏感已根據(jù)短時(shí)間、低濃度的應(yīng)激反應(yīng)，火腿偽鏢水蚤GST(δ-ε)、Prdx6基因可作為芘環(huán)境污染監(jiān)測的潛在生物標(biāo)志物。
　?、刍鹜葌午S水蚤對芘的脅迫非常敏感。短時(shí)間(24h)、低濃度(96h-LC50的0.5％)暴露即會(huì)對本研究中的多數(shù)基因(GST(δ-ε)、GPx2、Prdx6、Rac1)產(chǎn)生顯著的誘導(dǎo)效應(yīng)。
　?、蹽ST(δ-ε)基因在芘暴露24h

11、后表達(dá)量顯著增加，隨著暴露時(shí)間的增加，其表達(dá)量恢復(fù)到對照組水平，這一結(jié)果表明GST(δ-ε)基因在火腿偽鏢水蚤應(yīng)對芘脅迫的解毒過程中起著重要的作用，反應(yīng)十分迅速。
　?、軵rdx6基因在芘暴露24h后表達(dá)量顯著上調(diào)，且與暴露濃度正相關(guān)，隨著暴露時(shí)間的增加，Prdx6表達(dá)量下調(diào)。結(jié)果表明在短時(shí)間的暴露下，火腿偽鏢水蚤可上調(diào)Prdx6基因的表達(dá)，以保護(hù)自身膜系統(tǒng)免受氧化應(yīng)激損傷，但隨著暴露時(shí)間和暴露濃度的增加，可能由于未得到及時(shí)清除的