ATF3促進成年斑馬魚脊髓再生.pdf

1、背景：脊髓損傷是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)致殘性疾病,目前針對脊髓損傷尚無有效的治療手段和藥物。哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)擁有非常有限的修復和再生能力。與哺乳動物不同，斑馬魚在脊髓損傷后具有很強的修復和再生能力，成年斑馬魚在脊髓損傷后六周時間內(nèi)可基本恢復正常運動水平，但其具體機制尚不明確。已有研究證明活化轉錄因子3（ATF3）在斑馬魚視神經(jīng)損傷后可以促進視神經(jīng)細胞再生和修復。這提示我們，在斑馬魚脊髓損傷后，ATF3分子可能對神經(jīng)再生和修復起到重要作

2、用。
　　目的：本課題利用成年斑馬魚脊髓橫斷模型，探究ATF3在脊髓損傷后的mRNA和蛋白水平的變化。同時在抑制ATF3蛋白表達后，研究其對斑馬魚脊髓修復的影響和相關機制。
　　方法：選用4-6月齡的成年斑馬魚進行脊髓橫斷模型手術，在損傷后不同時間點取損傷點下段4mm的脊髓組織進行實時定量PCR，原位雜交以及免疫熒光，檢測ATF3 mRNA和蛋白變化，同時在脊髓損傷后不同時間點用免疫熒光共標ATF3與運動神經(jīng)元或ATF3與放

3、射狀膠質(zhì)細胞。斑馬魚脊髓損傷后，用ATF3 morpholino（MO）抑制斑馬魚脊髓損傷后ATF3蛋白質(zhì)表達，檢測斑馬魚運動恢復情況以及穿過損傷位點神經(jīng)軸突修復的水平變化，同時用實時定量 PCR的方法檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）mRNA的表達水平變化以探究炎癥因子對修復的影響。最后，利用顯微注射技術將ATF3 MO注射到斑馬魚胚胎中，探究ATF3分子對斑馬魚幼魚發(fā)育的影響。
　　結果：
　

4、　1.ATF3 mRNA水平在斑馬魚脊髓損傷后的4小時、12小時和6天維持在較高的表達水平，而在損傷后11天，其恢復到假手術組的表達水平。
　　2.ATF3蛋白水平在脊髓損傷后的4小時、12小時和6天表達水平升高，11天降低到假手術組水平。
　　3.ATF3蛋白表達在運動神經(jīng)元的細胞漿中，并且在脊髓損傷后12小時和6天表達水平增高。
　　4.ATF3蛋白毗鄰但不表達在放射狀膠質(zhì)細胞中，在脊髓損傷后6天，放射狀膠質(zhì)細胞數(shù)

5、量增加。
　　5.ATF3 MO抑制ATF3蛋白在斑馬魚脊髓內(nèi)表達后，脊髓損傷后第5和第6周，抑制組斑馬魚運動能力分別降低了36.4％和35.7%。
　　6.通過神經(jīng)示蹤技術發(fā)現(xiàn)，抑制脊髓ATF3表達六周后，神經(jīng)軸突修復被抑制。
　　7.抑制脊髓ATF3表達11天后，相比MO對照組，抑制組TNF-α和IL-1βmRNA表達水平維持在高水平，在脊髓損傷后21天，恢復到對照組水平。
　　8.ATF3 MO抑制ATF3