斑馬魚缺氧誘導(dǎo)因子-3α核定位信號(hào)的研究.pdf

1、缺氧誘導(dǎo)因子(HIFs)是最主要的能夠應(yīng)答細(xì)胞內(nèi)氧氣濃度的降低而對(duì)多種基因進(jìn)行調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子家族,與生物體的生長、發(fā)育及一些疾病的發(fā)病機(jī)理都有著密切的聯(lián)系。由于生物體內(nèi)缺氧現(xiàn)象較為普遍,所以有關(guān)HIF的結(jié)構(gòu)、功能以及與多種疾病之間的關(guān)系等一直是熱門的研究領(lǐng)域。HIF是一種異源二聚體蛋白,由α亞基和β亞基組成,其中α亞基受細(xì)胞內(nèi)氧氣濃度精密調(diào)控,對(duì)HIF功能的發(fā)揮是十分關(guān)鍵的。哺乳動(dòng)物中HIF-α一共有三個(gè)成員,分別稱為HIF-1α,HI

2、F-2α和HIF-3α,三者在蛋白結(jié)構(gòu)上較為保守。在缺氧狀態(tài)下,HIF-α得到穩(wěn)定積累并進(jìn)入細(xì)胞核與HIF-1β結(jié)合形成有功能的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 根據(jù)對(duì)HIF-1α和HIF-2α的研究可知,HIF-α無論在蛋白穩(wěn)定性還是其對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活功能方面都受到細(xì)胞內(nèi)多條途徑的調(diào)節(jié)。作為轉(zhuǎn)錄因子,HIF-α蛋白是否能從細(xì)胞質(zhì)成功被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核是其發(fā)揮功能的前提,所以針對(duì)HIF-α在細(xì)胞中亞定位的研究十分必要。已知分

3、子量大于50kDa的蛋白質(zhì)不同于小分子,它們需要通過消耗能量的主動(dòng)運(yùn)輸過程才能穿越核孔復(fù)合體進(jìn)入到細(xì)胞核中,在這些蛋白結(jié)構(gòu)上往往存在特殊的核定位信號(hào)(NLS)使得能夠蛋白質(zhì)被成功轉(zhuǎn)運(yùn)入核內(nèi)。文獻(xiàn)報(bào)道,在細(xì)胞中檢測(cè)外源性或內(nèi)源性的HIF-1α和HIF-2α蛋白發(fā)現(xiàn)兩者均能夠定位于細(xì)胞核中,并且缺氧能夠誘導(dǎo)兩種蛋白的表達(dá)全部集中于核內(nèi)。在HIF-1α和HIF-2α的蛋白結(jié)構(gòu)中,研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并證明了核定位信號(hào)存在的具體位點(diǎn)。在它們的C-端區(qū)

4、域都包含有一段富含堿性氨基酸(Lys和Arg)的片段,當(dāng)這些氨基酸被刪除或被替換成其它氨基酸時(shí)蛋白便完全失去進(jìn)入細(xì)胞核的能力。然而,由于HIF-3α較前兩者較晚被克隆得到,所以目前對(duì)該蛋白是否也為核內(nèi)蛋白,其進(jìn)核能力是否會(huì)受到氧氣濃度的影響以及該蛋白結(jié)構(gòu)上是否也存在核定位信號(hào)等等一系列的問題尚未得到解答。本研究的目的就是要對(duì)上述疑問一一進(jìn)行探討。以斑馬魚Hif-3α作為對(duì)象觀察該蛋白在細(xì)胞中的核質(zhì)分布以及確定其核定位信號(hào)存在的位點(diǎn)。從斑

5、馬魚體內(nèi)克隆得到了hif-3α的全長cDNA,其開放閱讀框共編碼626個(gè)氨基酸。通過氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該蛋白和人類的HIF-3α相似性在40％左右,說明兩者的保守性比較高。利用Hif-3α進(jìn)行核定位信號(hào)的研究能夠幫助我們完善對(duì)三種HIF-α亞基在結(jié)構(gòu)上相同點(diǎn)和不同點(diǎn)的認(rèn)識(shí)。
　　 將Hif-3α蛋白全長以及缺失N-端或C-端氨基酸片段的突變蛋白與EGFP構(gòu)建成融合蛋白后用相應(yīng)的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),在常氧時(shí)Hif-3α

6、-EGFP蛋白便已能夠集中于細(xì)胞核分布,缺氧并不能對(duì)它的細(xì)胞亞定位產(chǎn)生影響。而N-端或C-端區(qū)域缺失突變體轉(zhuǎn)染結(jié)果提示Hif-3α的C-端區(qū)域具有進(jìn)核的功能。利用特異性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)的β-Gal—EGFP蛋白進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明Hif-3α的C-端第518-567位和第568-626位兩個(gè)氨基酸片段各自具備進(jìn)核的功能。在每個(gè)片段中都存在堿性氨基酸對(duì)其功能的發(fā)揮有不可或缺的作用,它們分別為K524,R525,K578以及R579。在Hif-3α完

7、整蛋白的背景下將這些氨基酸突變后也使得蛋白的進(jìn)核能力明顯減弱。在這兩個(gè)堿性氨基酸簇之間有一段長為52個(gè)氨基酸的連接區(qū)域,這些氨基酸共同組成一段有核定位功能的結(jié)構(gòu)域,將其命名為Hif-3α的核定位信號(hào)。值得注意的是,發(fā)現(xiàn)Hif-3α N-端的第1—69位氨基酸片段也能夠介導(dǎo)β-Gal-EGFP進(jìn)入細(xì)胞核中,其中發(fā)揮作用的氨基酸為R14,K15,R25和R26。但是在全長蛋白中該片段卻并沒有真正的核定位功能,這與之前在HIF-1α和HIF-