桑椹花色苷提取物抗氧化與抗腫瘤生物學(xué)活性研究.pdf

1、桑椹為蕁麻目桑科桑屬植物桑(Morus L.)的果實(shí)，其藥用價(jià)值早在李時(shí)珍的《本草綱目》中有記載，即桑椹味甘，性微寒，能生津，有滋陰補(bǔ)血、安魂鎮(zhèn)神之效。我國已將桑椹列為“藥食同源”食材之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國2014年桑園面積為82.8萬公頃，作為桑樹的果實(shí)，桑椹資源的豐富可見一斑，但是尚未得到充分利用。目前桑椹的主要用途是加工成桑果酒、桑果醋。經(jīng)過文獻(xiàn)調(diào)研，除了對桑果酒、桑果醋的制備工藝外，研究者對桑椹的研究主要集中在花色苷、多糖、多酚等活

2、性物質(zhì)的提取工藝，生物活性部分以體外抗氧化為主，亦有部分文獻(xiàn)探討了桑椹活性物質(zhì)提取物對小鼠降血糖、降血脂方面的影響，而對于桑椹花色苷體內(nèi)抗氧化及其抗腫瘤作用鮮有報(bào)道。基于此，為了充分地利用桑椹資源，更好地開發(fā)桑椹的藥用功能，本論文研究了桑椹花色苷的提取與純化工藝，并探討其體內(nèi)體外抗氧化活性和抗腫瘤作用。
　　本論文主要由三部分組成:1、桑椹花色苷的提取與純化工藝研究;2、桑椹花色苷提取物對體內(nèi)體外抗氧化活性研究;3、桑椹花色苷提取

3、物的急性毒理與對腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用的研究。研究結(jié)果如下:
　　(1)提取:用蒸餾水、不同濃度乙醇、不同pH乙醇和丙酮等作為提取溶劑、以1∶40、1∶70、1∶100、1∶130為料液比進(jìn)行桑椹花色苷粗提取，確定最佳提取溶劑與料液比，然后進(jìn)行超聲30 min（超聲功率60 W）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:用含0.1％ HC1的75％乙醇，料液比為1∶100，桑椹花色苷提取液吸光度值達(dá)到最大，為1.563±0.019;在掃描電鏡下觀察了提取后的

4、桑椹粉末，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過超聲后的細(xì)胞壁破壞程度較僅用酸性乙醇提取的大。
　　(2)純化:比較了AB-8、HPD-100、D101三種大孔吸附樹脂對桑椹花色苷粗體物的純化，從上樣濃度、上樣pH等因素探討了三種吸附樹脂對粗提取吸附率的影響，并且用不同的乙醇濃度進(jìn)行洗脫。結(jié)果顯示，AB-8、HPD-100、D101對粗提取的吸附率分別為76.1％、77.9％、77.1％，解吸率依次為74.0％、43.1％、45.3％，結(jié)合兩者，最終選擇AB-

5、8大孔吸附樹脂為純化樹脂;
　　(3)花色苷含量測定:對純化后的桑椹花色苷提取物(mulberry fruit anthocyaninextraction，MFAE)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，然后進(jìn)行冷凍干燥，用pH示差法進(jìn)行總花色苷含量的測定,結(jié)果表明花色苷含量為38.07％;色價(jià)為171.2。
　　(4)亞鐵還原能力法(FRAP)和氧化自由基吸收能力法（ORAC）評價(jià)MFAE體外抗氧化活性，以上測定方法均以抗壞血酸(VC)為陽性對照

6、。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MFAE還原能力較VC弱，當(dāng)兩者濃度均為31.25μg/mL時(shí)，VC組吸光度值為0.728，花色苷提取物組吸光度值則為0.357，但氧自由基清除能力樣品組約為VC組的6.6倍，以Trolox作為氧、自由基清除實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物，MFAE的ORAC為9597.12μmol TE/g, VC組ORAC為1450.97μmol TE/g。
　　(5)實(shí)驗(yàn)用劑量為6000 mg/kg BW MFAE灌胃BALB/c小鼠，生理鹽水組

7、作為對照，研究MFAE對小鼠的急性毒理作用。每天觀察小鼠的體態(tài)體征，稱量小鼠體重，14天后摘眼球取血，檢測血常規(guī)、肝腎功，最后進(jìn)行解剖觀察各臟器情況，取肝和脾測定臟器系數(shù)。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組與對照組體態(tài)無異常，并且各檢測指標(biāo)呈不顯著差異，按照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）》急性毒理評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，MFAE可判定為實(shí)際無毒。
　　(6)實(shí)驗(yàn)每天給4組小鼠分別灌胃生理鹽水、VC、低劑量和高劑量MFAE溶液，連續(xù)30天，在31天時(shí)采

8、用溴代苯建立過氧化模型，最后測定各組小鼠肝組織和血中的脂質(zhì)過氧化物質(zhì)含量和有關(guān)過氧化物酶（超氧化物歧化酶和谷胱甘肽酶）活力，以鑒定MFAE體內(nèi)抗氧化活性。按照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）》評判物質(zhì)抗氧化標(biāo)準(zhǔn)，MFAE有降低脂質(zhì)過氧化作用，結(jié)果呈陽性。
　　(7)用靜態(tài)與動(dòng)態(tài)MTT法測定MFAE對乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的影響，觀察細(xì)胞形態(tài)、計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MFAE能使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，促使細(xì)胞皺縮，

9、時(shí)間越長，癌細(xì)胞增殖受抑制越明顯。
　　(8)用不同濃度MFAE處理MCF-724 h，隨后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期測定，MFAE對細(xì)胞周期阻滯在G2期。
　　(9)實(shí)驗(yàn)通過KM小鼠尾靜脈注射黑色素瘤細(xì)胞B16-F10，建立肺轉(zhuǎn)移模型。隨后分別灌胃生理鹽水、MFAE，注射達(dá)卡巴嗪(DITC)，隨后測定小鼠體重、肺部重量以及轉(zhuǎn)移灶數(shù)量等指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與生理鹽水組比，MFAE組肺部重量顯著低于生理鹽水組，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量亦較生理