鴿早期小腸發(fā)育及碳水化合物對(duì)其調(diào)控的研究.pdf

1、本研究以泰平王鴿為研究對(duì)象，通過(guò)研究孵化后期及出殼后兩周內(nèi)小腸形態(tài)、消化酶活性和小腸消化吸收相關(guān)功能基因表達(dá)的變化，揭示鴿早期發(fā)育階段小腸的消化生理特性。在此基礎(chǔ)上，采用孵化后期向羊膜腔補(bǔ)充外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的方法（胚蛋注射營(yíng)養(yǎng)，In ovo feeding），探討其對(duì)鴿小腸發(fā)育的早期營(yíng)養(yǎng)調(diào)控作用。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.鴿早期小腸形態(tài)和消化酶活性的發(fā)育規(guī)律
　　 腸絨毛在孵化期12d已初步形成，絨毛高度和絨毛表面

2、積在孵化期16d時(shí)迅速增加，其中十二指腸和空腸一直持續(xù)到14d;絨毛寬度從孵化期14d到出殼后24h內(nèi)增加顯著(P＜0.05);小腸隱窩在出殼當(dāng)天開(kāi)始形成內(nèi)陷結(jié)構(gòu)，并在出殼后3d內(nèi)生長(zhǎng)迅速(P＜0.05);十二指腸和空腸絨毛形態(tài)變化顯著大于回腸(P＜0.05);腸上皮細(xì)胞密度從孵化期12d到出殼后3d顯著增加(P＜0.05);粘膜DNA含量從孵化期12d到出殼當(dāng)天呈線性增加(P＜0.05);蛋白質(zhì)和DNA的比值出殼3d時(shí)開(kāi)始顯著增加(P

3、＜0.05);孵化期12d小腸可檢測(cè)到較低水平的麥芽糖酶、氨基肽酶-N、堿性磷酸酶和Na+-K+-ATP酶活性，孵化期14d可檢測(cè)到蔗糖酶活性;二糖酶比活力在出殼后8d時(shí)達(dá)到最大值，且空腸增長(zhǎng)速度顯著高于回腸和十二指腸(P＜0.05);氨基肽酶-N比活力在3d后不再隨日齡變化而變化;堿性磷酸酶比活力出殼前顯著增加(P＜0.05);Na+-K+-ATP酶比活力從孵化期12d到出殼后14d內(nèi)隨日齡呈線性增加(P＜0.05);空腸和回腸ATP

4、酶比活力增長(zhǎng)速度顯著高于十二指腸(P＜0.05)。小腸粘膜酶總活力從出殼后3-5d開(kāi)始顯著增加，并與體重隨日齡變化顯著線性正相關(guān)(P＜0.05);孵化期14d可檢測(cè)到胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性，孵化期16d可檢測(cè)到淀粉酶活性，胰腺酶活性隨日齡變化的發(fā)育規(guī)律與小腸相似。
　　 2.小腸刷狀緣酶及相關(guān)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的克隆及分析
　　 采用RT-PCR方法克隆得到鴿小腸鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體SGLT1、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT

5、2、寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1、氨基肽酶APN和蔗糖-異麥芽糖酶SI基因片段長(zhǎng)度分別為946bp、762bp、946bp、985bp和700bp。通過(guò)NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)Blast搜索結(jié)果表明這些序列為目的基因片段，提交到Genbank后獲得登陸號(hào)分別為JN887478、JN887480、JN887476、JN887477和JN887479;鴿SGLT1基因翻譯的氨基酸序列與斑胸草雀、火雞和雞一致性均在88％以上，與斑胸草雀的一致性最高，與人

6、、鼠、羊等哺乳類動(dòng)物也達(dá)到80％以上，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上與哺乳類動(dòng)物處于同一分支;鴿GLUT2、PepT1、APN和SI氨基酸序列與雞的一致性最高，與哺乳類動(dòng)物一致性較差，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上與哺乳類動(dòng)物處于不同分支。
　　 3.小腸刷狀緣酶及相關(guān)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的時(shí)空變化
　　 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，分析PepT1、SGLT1、GLUT2、APN和SI mRNA相對(duì)表達(dá)量在十二指腸、空腸和回腸（孵化期12、14和1

7、6d，出殼當(dāng)天，出殼后1、3、5、8和14d）以及卵黃囊膜（孵化期12、14、16d和出殼當(dāng)天）上的變化規(guī)律。結(jié)果表明，孵化后期12d，目的基因mRNA在小腸已經(jīng)開(kāi)始表達(dá);小腸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因mRNA相對(duì)表達(dá)量隨日齡呈一次線性增加(P＜0.05)，APN mRNA相對(duì)表達(dá)量隨日齡呈二次曲性增加(P＜0.05)，于孵化期16d顯著下降(P＜0.05)，出殼當(dāng)天再次增加(P＜0.05)，SI mRNA相對(duì)表達(dá)量隨日齡呈三次曲性增加(P＜

8、0.05)，于出殼當(dāng)天和出殼后8d時(shí)分別顯著上調(diào)(P＜0.05);十二指腸PepT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量最高，空腸SGLT1和GLUT2 mRNA相對(duì)表達(dá)量最高，回腸APN mRNA相對(duì)表達(dá)量最高，小腸各段SI mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P＞0.05);目的基因mRNA在卵黃囊膜各時(shí)期均有表達(dá)，且在出殼當(dāng)天顯著下調(diào)(P＜0.05)。
　　 4.胚蛋注射碳水化合物對(duì)鴿生長(zhǎng)和能量貯存狀態(tài)的影響
　　 通過(guò)分析鴿胚蛋不同孵

9、化日齡羊水體積變化，確定胚蛋注射時(shí)間為孵化期14.5d。選擇發(fā)育良好的含活胚蛋200枚，編號(hào)后隨機(jī)分成5個(gè)處理組，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)（每個(gè)重復(fù)分列于孵化箱內(nèi)的不同托盤上）。對(duì)照組不注射任何物質(zhì)，四個(gè)處理組注射營(yíng)養(yǎng)液如下:(Ⅰ)蔗糖15g/L，麥芽糖15g/L，NaCl7.5g/L;(Ⅱ)蔗糖25g/L，麥芽糖25g/L，NaCl7.5g/L;(Ⅲ)蔗糖35g/L，麥芽糖35g/L，NaCl7.5g/L;(Ⅳ)蔗糖45g/L，麥芽糖45g/

10、L，NaCl7.5g/L.預(yù)實(shí)驗(yàn)表明假注射和生理鹽水注射均不會(huì)顯著抑制鴿胚的生長(zhǎng)發(fā)育，故正式試驗(yàn)不再設(shè)假注射和生理鹽水注射作對(duì)照。于孵化期16d和出殼當(dāng)天進(jìn)行取樣分析，通過(guò)研究胚蛋注射不同水平碳水化合物溶液對(duì)鴿出殼率、體重以及能量貯存狀態(tài)的影響，探討胚蛋注射營(yíng)養(yǎng)技術(shù)在鴿中應(yīng)用的效果。結(jié)果表明，從孵化期16d到出殼當(dāng)天，各組中G6pase活性和血糖濃度均表現(xiàn)出上升的特點(diǎn)，而胸肌和糖原儲(chǔ)備均表現(xiàn)出下降的特點(diǎn)(P＜0.05);與對(duì)照組相比，試

11、驗(yàn)Ⅱ組顯著提高了雛鴿孵化率(P＜0.05)，但隨著碳水化合物注射溶液濃度的繼續(xù)增加，孵化率呈線性下降(P＜0.05);胚蛋注射48h后，試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ組鴿胚體重顯著高于其它各組(P＜0.05)，試驗(yàn)Ⅱ組鴿胚胸肌重顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組鴿胚小腸重顯著高于其它各組(P＜0.05);出殼當(dāng)天，試驗(yàn)Ⅱ組雛鴿體重和絕對(duì)體重顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組卵黃重顯著低于其它各組(P＜0.05)，試驗(yàn)Ⅱ組雛鴿肝臟、胸肌、

12、胃、和小腸重顯著高于對(duì)照組，且顯著提高了小腸相對(duì)重(P＜0.05);胚蛋注射48h后，血糖濃度隨碳水化合物濃度的增加呈線性增長(zhǎng)，G6pase活性則顯著下降;胚蛋注射48h后，試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ組鴿胚肝糖原含量均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，出殼當(dāng)天，試驗(yàn)Ⅱ組肌糖原濃度顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 5.胚蛋注射碳水化合物對(duì)鴿小腸早期發(fā)育的調(diào)控作用
　　 選擇發(fā)育良好的含活胚蛋160枚，編號(hào)后隨機(jī)分成2個(gè)處理組，每個(gè)處理

13、4個(gè)重復(fù)（每個(gè)重復(fù)分列于孵化箱內(nèi)的不同托盤上）。于孵化期14.5d進(jìn)行胚蛋注射。對(duì)照組不注射任何物質(zhì)，試驗(yàn)組注射營(yíng)養(yǎng)液成分:蔗糖25g/L，麥芽糖25g/L，NaCl7.Sg/L。于孵化期16d和出殼當(dāng)天進(jìn)行取樣分析，研究胚蛋注射碳水化合物溶液對(duì)鴿空腸絨毛形態(tài)，刷狀緣酶活性和消化吸收相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明孵化期16d和出殼當(dāng)天，胚蛋注射組空腸絨毛表面積比對(duì)照組分別增加了38％和23％(P＜0.05)，空腸麥芽糖酶比活力比對(duì)照組分別

14、增加了43％和52％(P＜0.05)，蔗糖酶比活力比對(duì)照組分別增加了39％和26％(P＜0.05)，空腸堿性磷酸酶比活力比對(duì)照組分別增加了44％和35％(P＜0.05);孵化期16d，胚蛋注射組空腸DNA含量比對(duì)照組提高了20％(P＜0.05);出殼當(dāng)天，胚蛋注射組空腸刷狀緣氨基肽酶-N比活力比對(duì)照組增加了27％(P＜0.05);胚蛋注射碳水化合物顯著提高了孵化期16d空腸SGLT1、GLUT2和APN mRNA相對(duì)表達(dá)量(P＜0.05

15、)。
　　 綜上所述，孵化后期及出殼后兩周內(nèi)鴿小腸形態(tài)、消化酶活性和消化吸收關(guān)鍵基因表達(dá)變化顯著，且隨日齡變化在小腸各段的發(fā)育模式各不相同，其中腸粘膜水解作用是鴿小腸早期發(fā)育階段消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的限速步驟;鴿出殼時(shí)小腸發(fā)育程度比肉雞等家禽低，表現(xiàn)為鴿小腸粘膜水解酶比活力的增加和絨毛的生長(zhǎng)一直持續(xù)到8-14d，而肉雞等家禽則在出殼后72h內(nèi)完成;鴿出殼后的早期發(fā)育過(guò)程中，小腸粘膜及胰腺中碳水化合物類水解酶變化比蛋白質(zhì)類水解酶顯著，