納米傳感針的研制及其對(duì)生物活性分子和中藥調(diào)控一氧化氮釋放監(jiān)測(cè)的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　傳統(tǒng)中醫(yī)藥以其整體治療及其獨(dú)特的科學(xué)理論而著稱于世。中醫(yī)藥在各類(lèi)疾病的病因病機(jī)及治療上均積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，但對(duì)其作用機(jī)制還有待深入研究。依據(jù)中醫(yī)藥理論，針對(duì)不同癥候，運(yùn)用不同復(fù)方，可使模型動(dòng)物全腦或著不同腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的水平發(fā)生變化。雖然這些變化在程度、性質(zhì)以及作用機(jī)理上均存在差異，但說(shuō)明中醫(yī)藥對(duì)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝具有重要的作用。同樣，針灸是中醫(yī)學(xué)的重要組成部分，根源于中國(guó)，也有著悠久的歷史。與藥

2、物的直接干預(yù)不同，針灸可能是通過(guò)激發(fā)機(jī)體的潛能，啟動(dòng)內(nèi)在的多種調(diào)控機(jī)制間接參與作用。針灸作用于穴位，人體穴位與經(jīng)脈的三維結(jié)構(gòu)處會(huì)發(fā)生分子事件。因此，研制測(cè)定穴位區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)水平和分子事件的傳感針，對(duì)闡明中藥和針灸的治病機(jī)理意義重大。
　　傳感針是以中醫(yī)針灸針為基體，應(yīng)用多種現(xiàn)代技術(shù)加工制備，賦予了其感知人體微區(qū)中的pH值、氧分壓、溫度、組織胺、鈣離子等信息變化的功能，具有中國(guó)特色。關(guān)于傳感針的較早研究多是在傳感的表面涂覆高分子敏感膜

3、用于監(jiān)測(cè)信號(hào)分子。然而高分子敏感膜修飾層是通過(guò)物理吸附到傳感針表面的，結(jié)合不牢固，且敏感膜厚度并不均勻，影響信號(hào)傳輸。最重要的一點(diǎn)是針刺入體內(nèi)，高分子敏感膜易脫落。而且此傳感表面粗糙，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)，很難實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的穩(wěn)定性。所以需要研制一種更為牢固，靈敏度高，性能足夠穩(wěn)定的傳感針。
　　納米材料具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)：例如比表面積大、催化效率高、吸附能力強(qiáng)、表面活性位點(diǎn)多等。近些年來(lái)利用納米材料特殊性質(zhì)，研究者將其引入傳感器的設(shè)計(jì)中，目的是提高傳感

4、器的靈敏度和特異性。其中，納米材料石墨烯因其具有大的比表面積、高導(dǎo)電性、較強(qiáng)的吸附性能和較快的電子傳遞速度及優(yōu)良的電催化活性等相關(guān)優(yōu)勢(shì)，成為了制備各類(lèi)傳感器的理想材料，在發(fā)展新型儲(chǔ)能材料、生物器件設(shè)計(jì)、生物分子檢測(cè)、生化分析和分子醫(yī)療診斷等多方面得到了廣泛的研究與重視。
　　本研究擬將納米技術(shù)與傳統(tǒng)針灸針結(jié)合，制備新型納米材料功能化的傳感針，用于生物活性分子如多巴胺（DA）、一氧化氮（NO）的檢測(cè)及中藥調(diào)控NO釋放監(jiān)測(cè)的研究。用此

5、納米傳感針實(shí)時(shí)在體監(jiān)測(cè)體內(nèi)重要生物活性分子，既可以反映中藥調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)作用，又可以探究針灸作用于人體穴位過(guò)程中產(chǎn)生的活性分子量的變化，為探討中藥或針灸治病機(jī)理提供理論和技術(shù)支持。
　　方法與結(jié)果：
　　運(yùn)用電化學(xué)方法制備石墨烯或功能化石墨烯修飾的針灸傳感針，用該納米傳感針實(shí)現(xiàn)了對(duì) pH、DA的電化學(xué)檢測(cè)和大鼠穴位處 NO的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。在此基礎(chǔ)之上，應(yīng)用納米傳感針對(duì)四種中藥活性成分調(diào)控NO釋放進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)研究。
　　本課題

6、的主要內(nèi)容包括以下三個(gè)部分：
　　第一部分：納米傳感針的研制及其用于檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺
　　首先用改進(jìn)的Hummers方法合成水溶性的氧化石墨烯（GO），采用拉曼光譜法對(duì)GO進(jìn)行表征；然后利用電化學(xué)循環(huán)伏安一步沉積法將GO還原修飾至針灸針的尖端，得到電化學(xué)還原的石墨烯（ERGO）修飾的傳感針（G-AN），并采用電化學(xué)循環(huán)伏安法（CV）考察修飾前后的納米傳感針的電化學(xué)性能。拉曼光譜的結(jié)果表明 GO合成成功。相比于裸針， G-A

7、N在鐵氰化鉀溶液中的氧化還原峰電流增加，說(shuō)明ERGO修飾層可以有效加速針灸針表面的電子傳遞。
　　為了探究G-AN對(duì)pH的響應(yīng)，我們采用開(kāi)路電位法，對(duì)不同pH的磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行測(cè)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用開(kāi)路電位法測(cè)量的電位幾秒鐘便達(dá)到穩(wěn)定，隨著溶液 pH的增加，電位信號(hào)負(fù)向增加。以 pH對(duì)電位作圖，可以看到在pH為2.0-10.0范圍內(nèi)，兩者呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為 E=0.0209-0.0299pH，R2＝0.992

8、1，線性方程顯示傳感針對(duì)pH響應(yīng)靈敏度為29.9 mV/pH。
　　最后，我們將G-AN用于對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（DA）的檢測(cè)。結(jié)果顯示，相比于裸針，DA在G-AN上的電化學(xué)響應(yīng)明顯增強(qiáng)，且在抗壞血酸（AA）共存條件下能夠成功區(qū)分DA與AA的不同氧化峰，說(shuō)明G-AN有較好的選擇性。在最優(yōu)條件下，將傳感針對(duì)DA進(jìn)行定量的分析，結(jié)果顯示在1.0×10-7 mol/L～1.0×10-5 mol/L范圍內(nèi)，DA的氧化峰電流與其濃度呈現(xiàn)良好的線

9、性關(guān)系，方法的檢出限為0.24μM，且將此傳感針在PBS溶液中放置一周后或插入鼠腦組織后，修飾層均呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性。最后采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，此傳感針實(shí)現(xiàn)了人體血清環(huán)境中DA的檢測(cè)。
　　第二部分：納米傳感針活體在穴實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)一氧化氮
　　首先在鐵卟啉和GO水溶液中，加入水合肼與氨水，通過(guò)一步還原法制備了卟啉功能化的石墨烯，然后采用掃描電鏡，紫外光譜法以及 X射線能譜對(duì)其進(jìn)行表征；制備傳感針時(shí)先在針灸針上濺射一層金顆粒，然后用電化學(xué)

10、方法將卟啉功能化的石墨烯沉積于針灸針尖端，針體部分絕緣。制備的傳感針結(jié)合了石墨烯優(yōu)越的電化學(xué)性能與鐵卟啉分子良好的催化性能，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞水平以及穴位處NO的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，溶液環(huán)境中，NO在此傳感針上的電化學(xué)響應(yīng)比裸針明顯增強(qiáng)，說(shuō)明功能化石墨烯修飾層能夠有效加速針灸針表面的電子傳遞。在干擾物存在的條件下能夠成功檢測(cè)NO，說(shuō)明此傳感針抗干擾能力強(qiáng)。在最優(yōu)條件下，將該傳感針用于溶液中NO的定量分析，結(jié)果顯示在5.0×10-

11、9 mol/L～2×10-7 mol/L范圍內(nèi)，NO的氧化峰電流與其濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，方法檢出限為3.2 nM，將傳感針置于1 M KCl溶液中保存10天后，其電流信號(hào)仍保持在初始電流信號(hào)的82％以上，顯示該傳感針具有較好的穩(wěn)定性。
　　隨后，將此傳感針用于細(xì)胞水平 NO的檢測(cè)。精氨酸（L-Arg）在細(xì)胞一氧化氮合酶（NOS）的催化作用下可以形成NO。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)加入 L-Arg刺激細(xì)胞時(shí)，電流信號(hào)明顯增大，隨時(shí)間增長(zhǎng)又

12、趨于穩(wěn)定；而當(dāng)精氨酸甲酯（L-NAME）與細(xì)胞共孵育后，再加入 L-Arg刺激細(xì)胞，由于 L-NAME的抑制作用，沒(méi)有檢測(cè)到 NO的響應(yīng)電流。沒(méi)有細(xì)胞存在情況下，加入 L-Arg刺激，也不會(huì)產(chǎn)生電流信號(hào)的變化。說(shuō)明我們制備的功能化的針灸傳感針可以實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞水平NO的釋放。
　　在此基礎(chǔ)上，利用該傳感針在大鼠穴位處進(jìn)行活體實(shí)時(shí) NO監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)，將功能化的傳感針?lè)謩e刺入成年大鼠不同穴位，足三里、曲池和中腕，當(dāng)加入 L-Arg刺激穴位時(shí)

13、，發(fā)現(xiàn)電流信號(hào)明顯增加，說(shuō)明在 L-Arg刺激下NO會(huì)在穴位處釋放并能被實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)到。作為空白實(shí)驗(yàn)，在穴位處加入PBS時(shí)，無(wú)明顯電流信號(hào)變化，說(shuō)明監(jiān)測(cè)到的NO信號(hào)是在穴位通過(guò) L-Arg的刺激而產(chǎn)生的，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明該傳感針具有活體實(shí)時(shí)檢測(cè)的能力。
　　第三部分：中藥活性成分對(duì)細(xì)胞水平NO釋放的影響
　　NO產(chǎn)生或釋放異?？赡芙閷?dǎo)多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。因此調(diào)控NO生理水平具有極其重要的治療意義。實(shí)驗(yàn)涉及的四種單味藥有青藤、益母

14、草、葛根和大蒜，其主要活性成分分別為青藤堿、水蘇堿、葛根素以及大蒜素。首先觀察四種藥物對(duì)細(xì)胞活性的影響，人體臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）培養(yǎng)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，與不同濃度的藥物作用24 h后，用MTT法和熒光染色法觀察細(xì)胞的活性，結(jié)果顯示不同藥物在50μg/mL濃度或者更低濃度對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性作用。
　　采用NO還原酶試劑盒方法檢測(cè)不同藥物培養(yǎng)下細(xì)胞NO釋放水平，通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以得知，青藤堿與水蘇堿對(duì)HUVECs中NO

15、釋放有抑制的作用，而葛根素和大蒜素對(duì)HUVECs中NO釋放有促進(jìn)的作用。再者，將納米傳感針置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并加入 L-Arg刺激，使用電化學(xué)三電極系統(tǒng)，實(shí)時(shí)電流法進(jìn)行檢測(cè)不同藥物對(duì)NO釋放電流信號(hào)的影響。在藥物共孵育的 HUVECs中加入 L-Arg刺激，其電流信號(hào)與無(wú)藥物的對(duì)照組有明顯不同。水蘇堿和青藤堿作用組電流明顯要小于對(duì)照組；而葛根素和大蒜素作用組電流要高于對(duì)照組電流。說(shuō)明此傳感針檢測(cè)的中藥調(diào)控NO水平結(jié)果與試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致

16、。
　　結(jié)論：
　　1.將納米技術(shù)與傳統(tǒng)針灸針相結(jié)合，制備了納米材料功能化的針灸傳感針。
　　2.所制備的納米傳感針具有靈敏度高，選擇性好，修飾層穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
　　3.石墨烯修飾的傳感針實(shí)現(xiàn)了對(duì)pH以及神經(jīng)遞質(zhì)DA的檢測(cè)，且可以用于血清環(huán)境中DA的檢測(cè)。
　　4.卟啉功能化石墨烯修飾的傳感針實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞水平以及活體在穴實(shí)時(shí)NO的監(jiān)測(cè)。
　　5.中藥活性成分水蘇堿和青藤堿可以抑制細(xì)胞中NO釋放；相反，葛根