生物鐘調(diào)控一氧化氮(NO)信號(hào)的研究.pdf

1、生物鐘，又稱近晝夜鐘或節(jié)律（circadian clock or circadian rhythms），是以大約24小時(shí)為周期的生物節(jié)律現(xiàn)象。生物鐘是生活在地球上的各種生命對(duì)地球每日光和溫度的循環(huán)變化長期適應(yīng)和演化的結(jié)果。從簡單的單細(xì)胞細(xì)菌到復(fù)雜的人都有近晝夜節(jié)律。
　　在哺乳動(dòng)物中，同步內(nèi)部時(shí)間和外界環(huán)境的因素主要是光因子。對(duì)處于持續(xù)黑暗中的小鼠施以簡短的曝光處理，能夠引起時(shí)相遷移。谷氨酸是被普遍認(rèn)為的能夠介導(dǎo)光誘導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)。

2、已有研究表明，用谷氨酸短暫處理小鼠視交叉上核能引起小鼠類似光時(shí)相遷移，這種變化可以被NMDAR(N-甲基-D-天冬氨酸受體，谷氨酸受體)抑制劑和一氧化氮（NO）信號(hào)有效地阻止。NO，作為一種多功能氣體信號(hào)分子,影響各種生命過程。然而關(guān)于一氧化氮和生物鐘之間的關(guān)系及作用機(jī)制卻知之甚少。
　　在本研究中，斑馬魚幼魚的DAF-FM DA熒光染色結(jié)果顯示在發(fā)育初期一氧化氮信號(hào)主要定位在斑馬魚的心臟、脊索、匙骨和尾鰭部位并呈現(xiàn)節(jié)律性累積。一

3、氧化氮是由一氧化氮合成酶(NOS)催化合成的。斑馬魚基因組含有nos1、nos2a、nos2b三個(gè)一氧化氮合成酶。為了闡明一氧化氮節(jié)律性產(chǎn)生的分子機(jī)制，我們利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)斑馬魚的三個(gè)一氧化氮合成酶(nos1， nos2a，nos2b)的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果表明三個(gè)nos基因在LD(Light：Dark)和DD（Constant Darkness）狀態(tài)下都有節(jié)律性震蕩。為了更好地闡明其表達(dá)模式，我們構(gòu)建了nos2a和n

4、os2b的轉(zhuǎn)基因魚，證明了一氧化氮合成酶確實(shí)受到內(nèi)在的生物鐘控制。同時(shí)我們構(gòu)建了由三個(gè)nos啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，進(jìn)行了體外的細(xì)胞共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)三個(gè)一氧化氮合成酶的節(jié)律性表達(dá)并不受E-box介導(dǎo)的Bmal1b/Clock1a二聚體和RRE元件介導(dǎo)的Rorα調(diào)控而是受D-box元件介導(dǎo)的Tefα調(diào)控。說明一氧化氮合成酶受到生物鐘控制并不是通過E-box和RRE元件，而是通過D-box受到生物鐘控制。另一方面，上半夜對(duì)幼魚實(shí)施以1

5、00μM的SNP(NO供體)處理使斑馬魚時(shí)相延遲，而下半夜100μM的SNP的處理使斑馬魚幼魚的總體活動(dòng)量明顯高于野生型斑馬魚，并縮短了斑馬魚幼魚的活動(dòng)周期。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)上半夜對(duì)幼魚的SNP處理使bmal1b和clock1a基因表達(dá)水平上調(diào)，而per2和cry1ab的表達(dá)水平則下調(diào)，在下半夜的SNP處理則使bmal1b和clock1a基因表達(dá)不再震蕩，per2和cry1ab的表達(dá)水平下調(diào)。說明一氧化氮信號(hào)也能夠影響內(nèi)在生物鐘、鐘基因及其