脂肪間充質(zhì)干細胞及其構(gòu)建物新型低溫保存方法研究.pdf

1、低溫保存對于細胞、組織、器官甚至新近出現(xiàn)的生物復(fù)合物的長期儲存是一種有效的不可或缺的方法，被廣泛應(yīng)用到干細胞治療、生物組織工程、再生醫(yī)學(xué)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。低溫的深度保存(-196℃)主要包括慢速降溫的兩步法保存和快速的玻璃化保存。慢速降溫的兩步法保存是目前應(yīng)用最廣的方法，但仍然存在著一定的缺陷，尤其是在干細胞及生物材料的保存中。在慢速降溫的兩步法保存過程中，細胞或生物材料內(nèi)會產(chǎn)生冰晶，這將造成細胞和生物材料的機械性損傷，而且在慢速降溫過程

2、中還存在著溶質(zhì)損傷。同時，干細胞的慢速保存可能會影響干細胞功能等。玻璃化低溫保存可以避免在冷凍降溫時冰晶的形成，但是傳統(tǒng)的玻璃化保存應(yīng)用到了高濃度的低溫保護劑，這會造成細胞的毒性損傷。因此，探索低濃度低溫保護劑下的玻璃化低溫保存方法是非常必要的。低濃度玻璃化保存方法面臨最大的挑戰(zhàn)是復(fù)溫過程中再結(jié)晶的發(fā)生，所以，了解再結(jié)晶發(fā)生的原因以及影響因素是非常重要的。
　　本文首先利用低溫顯微鏡檢測了懸浮和貼壁兩種狀態(tài)下的細胞在不同降溫速率下

3、和不同溶液中的胞內(nèi)冰和再結(jié)晶的形成概率以及冷凍復(fù)溫后細胞的活性。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著降溫速率的增加，胞內(nèi)冰和再結(jié)晶的形成概率有所增加。同時，在有1M DMSO存在的條件下，胞內(nèi)冰和再結(jié)晶的形成會比在PBS中有所延遲。雖然在1M DMSO溶液中，胞內(nèi)冰和再結(jié)晶的形成概率比在PBS溶液中高些，但是復(fù)溫后的存活率也高，這可能是因為冰晶形成只是細胞損傷的一種因素，在低溫保存中，低溫保護劑可以保護細胞，比如穩(wěn)定細胞膜等。相對于懸浮細胞，貼壁細胞在同樣

4、的降/復(fù)溫過程中，其胞內(nèi)冰形成概率會高很多，但是復(fù)溫后的細胞活性卻比懸浮細胞要高，這是因為細胞間的間隙連接可以避免細胞在冷凍過程中過度脫水，同時在低溫環(huán)境下保護細胞等。
　　已有研究表明納米顆粒在溶液冷凍時可以促進其冰晶形成等，而Fe3O4納米顆粒已經(jīng)被應(yīng)用到組織冷凍的復(fù)溫過程中，但是它對凍存溶液的影響研究的還不多，因此我們利用低溫顯微鏡觀察不同濃度的Fe3O4納米顆粒對溶液冰晶形成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶液中添加Fe3O4納米顆粒

5、后，冰晶成核的溫度點會提高10℃左右，同時冰晶生長的速率也會增加。這是因為在這個冷凍過程中，納米顆粒可以被看作是冰晶形成的成核劑從而促進冰晶成核及生長。
　　在以往的低濃度低溫保護劑的玻璃化低溫保存研究中，人們常常用海藻酸鹽凝膠來抑制復(fù)溫過程中反玻璃化的發(fā)生，但是對于海藻酸鹽水凝膠的低溫顯微鏡的研究還比較少。我們利用低溫顯微鏡來研究一定厚度(200μm)的海藻酸鹽水凝膠對冰晶形成的影響以及低溫環(huán)境對海藻酸水凝膠微球結(jié)構(gòu)的影響，我們

6、發(fā)現(xiàn)在冷凍過程中海藻酸鹽水凝膠內(nèi)僅有少量的冰晶形成，且在復(fù)溫過程中沒有再結(jié)晶發(fā)生，這說明了海藻酸鹽水凝膠在一定程度上可以抑制冰晶的形成和再結(jié)晶的發(fā)生。同時，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)蜏乇Ｗo劑濃度大于1M（滲透性）時，海藻酸鹽水凝膠微球的形態(tài)不會受到冷凍復(fù)溫的影響。在較低濃度的滲透性低溫保護劑(2M)存在時，形成的冰晶邊界多是尖銳的，而在高濃度的滲透性低溫保護劑(4M)或是在2M滲透性低溫保護劑和1.3M海藻糖存在時，形成的冰晶邊界多是圓潤、光滑的。因

7、此，在低溫保存細胞等生物樣品時，糖的添加會大大提高保存效率。我們利用DSC方法檢測了海藻酸鹽水凝膠微球?qū)Σ煌瑵舛鹊蜏乇Ｗo劑結(jié)晶量的影響，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使在較低濃度的低溫保護劑存在時，有海藻酸鹽水凝膠微球的會比沒有的結(jié)晶量少很多，這說明了這樣凝膠可以促進水向玻璃化狀態(tài)轉(zhuǎn)變。
　　為了解決低濃度保護劑玻璃化低溫保存過程中的再結(jié)晶等問題，我們探索了一種新的通過Fe3O4納米顆粒與微膠囊化海藻酸鹽水凝膠相結(jié)合的方法，成功實現(xiàn)了干細胞-海藻

8、酸鹽水凝膠構(gòu)建物的低濃度低溫保護劑下的玻璃化保存。在以往的細胞封裝保存過程中，大部分采用是單一的海藻酸鹽水凝膠結(jié)構(gòu)，而在我們的實驗中，我們采用了“核殼”結(jié)構(gòu)膠囊，外部的海藻酸鹽水凝膠外殼不僅可以保護細胞免受封裝時溶液剪切力的損傷，也避免細胞在復(fù)溫過程中冰晶的損傷，同時，這個外殼還可以把Fe3O4納米顆粒與細胞隔離開。在復(fù)溫過程中，海藻酸鹽水凝膠可以在一定程度上抑制再結(jié)晶的發(fā)生，同時，在交變電磁場下，保護劑溶液中的Fe3O4納米顆?？梢援a(chǎn)

9、生均勻熱量進一步抑制局部以及整體溶液的再結(jié)晶或反玻璃化的發(fā)生。與傳統(tǒng)的復(fù)溫相比，這種納米復(fù)溫的方法把干細胞的貼壁效率從24％提高到68％，這對于其后期的應(yīng)用尤為重要。此外，這種納米復(fù)溫方法也確保了干細胞-水凝膠構(gòu)建物結(jié)構(gòu)的完整和3D培養(yǎng)中細胞的有效增殖。這種新的納米復(fù)溫方法對于促進基于干細胞以及干細胞-水凝膠構(gòu)建物等應(yīng)用到臨床領(lǐng)域有著潛在的價值。
　　另外，為了排除生物實驗過程中溶液滲透壓對實驗結(jié)果的影響以及更全面地檢測細胞活性，