夏枯草物質(zhì)基礎(chǔ)構(gòu)成三萜組分防治肺癌作用與機(jī)制研究.pdf

1、肺癌的發(fā)生率和死亡率居惡性腫瘤的首位。肺癌難以早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷，而很多病例一經(jīng)臨床發(fā)現(xiàn)，即已進(jìn)入中晚期，因此，對(duì)肺癌進(jìn)行防治，降低肺癌的發(fā)生率和延緩肺癌的進(jìn)一步發(fā)展具有重要作用。中醫(yī)“治未病”思想與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的化學(xué)預(yù)防異曲同工，其目的均是用藥物阻斷和逆轉(zhuǎn)肺癌的發(fā)生、發(fā)展。夏枯草(Prunellavulgaris.L)為唇形科植物，性苦寒，具清熱解毒之功效，其化學(xué)成分主要包括三萜類、黃酮類、酚酸類、多糖類等成分，防治肺癌的療效確切，并在

2、臨床上廣泛使用。
　　 肺癌發(fā)生、發(fā)展對(duì)肺癌的防治具有重要作用。本課題研究以中醫(yī)藥“治未病”的思想為指導(dǎo)，以夏枯草三萜組分組分為模型藥物，從整體細(xì)胞水平、分子蛋白水平，研究夏枯草防治肺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用與機(jī)制。主要內(nèi)容:
　　 1.夏枯草三萜組分組分的富集分離
　　 用70％乙醇提取夏枯草，大孔樹(shù)脂和自動(dòng)純化系統(tǒng)分離純化和富集三萜類組分;采用UPLC對(duì)分離過(guò)程中的各個(gè)樣品進(jìn)行表征;建立人肺腺癌A549細(xì)胞體外藥

3、效篩選體系，評(píng)價(jià)所得夏枯草三萜組分組分防治肺癌活性。研究結(jié)果表明:UPLC檢測(cè)自動(dòng)純化后的1號(hào)樣品為夏枯草三萜組分，其對(duì)A549的IC50為125.30μg/mL。
　　 2.夏枯草三萜組分防治肺癌作用研究:
　　 (1)夏枯草三萜組分對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞線粒體膜電位的影響:
　　 研究夏枯草三萜組分對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電位的作用。夏枯草三萜組分作用A549細(xì)胞24h，線粒體膜電位差呈上升趨勢(shì)，當(dāng)夏枯草三萜組

4、分的濃度達(dá)到400μg/ml時(shí)，線粒體膜電位與空白組相比，顯著性升高（*P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，夏枯草三萜組分可以通過(guò)改變線粒體膜電位誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡。
　　 (2)夏枯草三萜組分對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的影響:
　　 夏枯草三萜組分可以促進(jìn)凋亡蛋白的表達(dá)。夏枯草三萜組分作用于A549細(xì)胞24h后，westernblot結(jié)果顯示，夏枯草三萜組分能顯著性增加促凋亡蛋白cleaved-caspase

5、3、cleaved-caspase8、cleaved-caspase9、Bax的表達(dá)（*P＜0.05，**P＜0.01）;顯著性降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)(*P＜0.05)。結(jié)果表明夏枯草三萜組分可以誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡，對(duì)防治肺癌具有重要意義。
　　 (3)夏枯草三萜組分對(duì)CSE誘導(dǎo)的NHBE細(xì)胞周期的影響
　　 建立香煙誘導(dǎo)模型，考察夏枯草三萜組分防治肺癌的作用。夏枯草三萜組分作用于CSE誘導(dǎo)的NHBE細(xì)胞后

6、24h后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)G1期細(xì)胞從79.22％下降到49.52％，S期細(xì)胞從7.52％上升到45.63％，說(shuō)明夏枯草三萜組分能夠有影響CSE誘導(dǎo)的NHBE細(xì)胞周期中的G1/S調(diào)控點(diǎn)，使NHBE細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，從而起到預(yù)防腫瘤的作用。
　　 (4)夏枯草三萜組分對(duì)CSE誘導(dǎo)的NHBE細(xì)胞凋亡的影響:
　　 建立香煙誘導(dǎo)模型，考察夏枯草三萜組分防治肺癌的作用。夏枯草三萜組分作用于CSE誘導(dǎo)的N

7、HBE細(xì)胞后24h后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)凋亡率從從19.41％下降到12.48％。說(shuō)明夏枯草三萜組分可以阻止人正常肺支氣管上皮細(xì)胞凋亡，從而預(yù)防肺癌的發(fā)生。
　　 3.夏枯草三萜組分防治肺癌的機(jī)制研究
　　 (1)夏枯草三萜組分對(duì)CSE誘導(dǎo)的NHBE細(xì)胞中抗氧化指標(biāo)的影響
　　 細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶具備清除自由基，提高胞內(nèi)抗氧化水平，減少氧化損傷的作用。夏枯草三萜組分可以恢復(fù)細(xì)胞中SOD、CAT、MD

8、A和GSH的水平，達(dá)到抗氧化的結(jié)果。研究結(jié)果說(shuō)明所建立的抗氧化模型能有效反映夏枯草三萜組分的抗氧化能力，所建立的模型能為防治肺癌的抗氧化機(jī)制評(píng)價(jià)提供方法。
　　 (2)夏枯草三萜組分對(duì)CSE誘導(dǎo)的NHBE細(xì)胞中抗炎指標(biāo)的影響
　　 以VE為陽(yáng)性藥，探討夏枯草三萜組分對(duì)細(xì)胞炎性指標(biāo)COX-2和ICMA-1的影響，發(fā)現(xiàn)其能顯著性降低CSE誘導(dǎo)的COX-2和ICMA-1的表達(dá)，使其接近于正常水平，揭示其防治肺癌的機(jī)制和COX-

9、2和ICMA-1的表達(dá)有關(guān)。研究結(jié)果表明所建立的體外抗炎模型能有效地、客觀地評(píng)價(jià)夏枯草三萜組分的抗炎能力，為防治肺癌的機(jī)制研究殿下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 (3)夏枯草三萜組分對(duì)Ⅱ相酶的調(diào)控作用機(jī)制研究
　　 以NHBE細(xì)胞和昆明小鼠為模型，研究夏枯草三萜組分對(duì)Ⅱ相酶的調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)夏枯草三萜組分可以引起NHBE細(xì)胞和KM小鼠的應(yīng)激性，啟動(dòng)自我防護(hù)機(jī)制，具體表現(xiàn)為提高NQO1和Nrf2蛋白的表達(dá)，繼而提高Ⅱ相解毒酶NQO

10、1和GST的活力及表達(dá)，提高GSH的含量，說(shuō)明夏枯草三萜組分通過(guò)對(duì)Ⅱ相解毒酶的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌的化學(xué)預(yù)防。
　　 結(jié)論:夏枯草用70％乙醇提取，用大孔樹(shù)脂和自動(dòng)純化系統(tǒng)進(jìn)行分離和純化和富集，得到純度較高的夏枯草三萜組分。夏枯草三萜組分對(duì)NHBE細(xì)胞的抑制率較A549人肺腺癌細(xì)胞低。CSE可以引起NHBE細(xì)胞損傷，并且具有濃度依賴性，在10％CSE作用24h的情況下，對(duì)NHBE細(xì)胞的抑制率約為30％，當(dāng)加入200μg/mL夏枯草三

11、萜組分會(huì)可以使其抑制率降低至13.67±1.4％，說(shuō)明夏枯草三萜組分具有保護(hù)正常細(xì)胞的作用。夏枯草三萜組分通過(guò)升高A549細(xì)胞的線粒體跨膜電位，促進(jìn)caspase3、caspase8、caspase9蛋白的表達(dá)，降低Bcl-2/Bax的比例，誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤發(fā)展。在CSE誘導(dǎo)的NHBE細(xì)胞模型中，夏枯草三萜組分可以調(diào)控NHBE細(xì)胞的細(xì)胞周期，使G1期細(xì)胞從79.22％下降到49.52％，S期細(xì)胞從7.52％上升到45.