Ikaros不同可變剪切體對細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、分類號：密級：UDC：學(xué)號：T104112015021033南昌大學(xué)同等學(xué)力申請碩士學(xué)位研究生學(xué)位論文Ikaros不同可變剪切體對細(xì)胞增殖和凋亡的影響不同可變剪切體對細(xì)胞增殖和凋亡的影響EffectsofdifferentIkarosisofmsoncellproliferationapoptosis易麗君培養(yǎng)單位（院、系）：南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院指導(dǎo)教師姓名、職稱：曾小平副教授申請學(xué)位的學(xué)科門類：醫(yī)學(xué)學(xué)科專業(yè)名稱：免疫學(xué)論文答辯日期：20

2、18年5月31日答辯委員會主席：評閱人：年月日摘要摘要目的目的通過分析兒童急性淋巴細(xì)胞白血病臨床骨髓樣本中Ikaros的不同表現(xiàn)亞型，初步探討Ikaros缺失性突變(功能缺失)對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響以及引起多藥耐藥的可能分子機制，為兒童ALL的個性化治療靶點提供理論依據(jù)。方法方法(1)收集110例2013年2015年在江西省兒童醫(yī)院確診的兒童急性淋巴細(xì)胞白血病患兒的骨髓樣本，所收集的樣本均獲得患兒家屬及醫(yī)院倫理委員會的同意。(2)利用淋

3、巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，提取總RNA，測定RNA的濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，巢式PCR及克隆測序分析確定患兒Ikaros的表達亞型，分析Ikaros表達亞型與臨床其它實驗指標(biāo)的相關(guān)性，并且統(tǒng)計Ikaros異常表型與預(yù)后的相關(guān)性。(3)以IK1作為Ikaros功能型代表，以IK6為Ikaros無功能型代表，通過構(gòu)建Ikaros功能型型和無功能型表達載體，在人胚腎293T細(xì)胞株中，按照轉(zhuǎn)染試劑Lip2000說明書的操作流程，將pcD

4、NA3.1vect、pcDNA3.1IK1、pcDNA3.1IK6分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48小時后收集細(xì)胞進行下游實驗。細(xì)胞提取總蛋白，免疫蛋白印跡法(westernblotWB)檢測IK1和IK6，MTT法檢測細(xì)胞的增殖率，WB檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl2的表達水平，化學(xué)發(fā)光法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)因子caspase3水平，通過各項檢測指標(biāo)，說明IK1和IK6對293T細(xì)胞增殖和凋亡生物學(xué)行為的影響。同時通過qPCR熒光定量檢測細(xì)胞細(xì)胞凋亡

5、相關(guān)基因(BCL2、BAX)的表達水平，比較缺失突變型Ikaros對細(xì)胞的影響。分析Ikaros功能狀態(tài)影響PI3KAKT信號通路的分子機制及參與細(xì)胞凋亡的分子機制。經(jīng)pubmed序列比對，設(shè)計引入酶切位點（BamHI和XhoI）的Ikaros引物，PCR擴增，經(jīng)膠回收后與表達載體pcDNA3.1表達載體同時進行雙酶切，利用T4連接酶連接，對可疑陽性重組子的基因序列測序鑒定。(4)慢病毒包裝GV3583FLAGEGFPPUROIK6(L