Islet-1募集組蛋白乙?；瘡?fù)合體促干細(xì)胞特化心肌樣細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：篩選并鑒定轉(zhuǎn)染Islet-1慢病毒載體的C3H10T1/2細(xì)胞特化心肌樣細(xì)胞過程中Islet-1募集的組蛋白乙?；瘡?fù)合體；明確Islet-1在C3H10T1/2細(xì)胞特化乙?；募蛹?xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵樞紐作用。
　　方法：
　　1.轉(zhuǎn)染Islet-1慢病毒載體至C3H10T1/2細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　2.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測Islet-1在C3H10T1/2細(xì)胞的表達(dá)部位，Western-blot檢測誘導(dǎo)組I

2、slet-1各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)情況和各實(shí)驗(yàn)組(誘導(dǎo)組、空白對(duì)照組、C3H10組)Isin-1表達(dá)量的差異。
　　3.Co-IP沉淀Islet-1募集的蛋白復(fù)合體，SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍(lán)染色、脫色，HPLC-CHIP-NanoSpray-ESI-MS/MS篩選鑒定Islet-1募集的蛋白復(fù)合體。
　　4.從組蛋白乙?；嚓P(guān)蛋白及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白角度，用swiss-port、ExpAsy數(shù)據(jù)對(duì)步驟3中質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分

3、析。
　　5.Western-blot驗(yàn)證與Islet-1相互作用的HATs和HDACs及FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)蛋白。
　　結(jié)果：
　　1.誘導(dǎo)組細(xì)胞及空白對(duì)照組細(xì)胞感染Islet-1慢病毒后4天可檢測到有綠色熒光蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)組細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染效率為88.82％，空白對(duì)照組細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染效率為90.12％。誘導(dǎo)組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染慢病毒培養(yǎng)3周后細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)一致，成纖維細(xì)胞樣，立體感強(qiáng)?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞則在培養(yǎng)3周后排

4、列散亂無規(guī)則，成短棒狀。C3H10組細(xì)胞培養(yǎng)3周后形態(tài)無明顯變化。
　　2.各實(shí)驗(yàn)組Islet-1主要表達(dá)在C3H10細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，誘導(dǎo)組熒光強(qiáng)度(5707.220±174.20)顯著高于空白對(duì)照組(239.584±6.321)及C3H10組(241.377±6.197)(P<0.05)。誘導(dǎo)組Islet-1表達(dá)量在3周(0.782±0.015)和4周(0.780±0.034)時(shí)顯著高于1周(0.127±0.006)和2周(0.12

5、8±0.004)(P<0.05)。3周、4周Islet-1表達(dá)無顯著差異(P<0.01)。誘導(dǎo)組Islet-1表達(dá)量(0.819±0.026)顯著高于空白對(duì)照組(0.127±0.006)及C3H10組(0.126±0.001)(P<0.05)。
　　3.誘導(dǎo)組Islet-1表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組及C3H10組(P<0.05)，各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過SDS-PAGE分離和考馬斯亮藍(lán)分離染色，排除非特異性條帶后，得到7條質(zhì)譜條帶。
　　

6、4.通過質(zhì)譜鑒定和分析蛋白相關(guān)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)得到Islet-1募集的蛋白復(fù)合物為：DNA連接蛋白和FGF信號(hào)蛋白。
　　5.Western-blot驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　(1)Islet-1募集的復(fù)合體中存在組蛋白乙酰化相關(guān)蛋白：GCN5、P300/CBP、PCAF和HDAC4、HDAC5。
　　(2)FGF10信號(hào)蛋白：FGF10及其受體FGF2rb也存在于Islet-1募集的復(fù)合體中。
　　結(jié)論：
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