炎性反應(yīng)在多壁碳納米管致胸膜間皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用.pdf

1、目的:
　　多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs)是目前應(yīng)用最為廣泛的新型納米纖維材料，在纖維特征和暴露方式上與石棉極其相似，故其對人體能否產(chǎn)生與石棉類似的危害效應(yīng)受到高度關(guān)注?，F(xiàn)有研究表明，MWCNTs能誘導(dǎo)動(dòng)物間皮瘤（2017年被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為2B類致癌物），對人類具有巨大的潛在威脅，但其作用機(jī)制不明;中國是MWCNTs的生產(chǎn)和消費(fèi)大國之一。所以，研究MWCNTs致胸膜間

2、皮瘤的分子機(jī)制，可為更準(zhǔn)確地評價(jià)其安全性，制定有效防治措施提供科學(xué)依據(jù)，無疑具有重要的科學(xué)意義和實(shí)際意義。
　　MWCNTs的炎性誘導(dǎo)作用是其目前較公認(rèn)的主要毒效應(yīng)機(jī)制之一，慢性炎癥是石棉致胸膜間皮瘤發(fā)生發(fā)展中的重要因素，胸膜腔持續(xù)的慢性炎癥也是MWCNTs致小鼠胸膜腔間皮瘤的顯著特征。所以，慢性炎癥在MWCNTs致胸膜間皮瘤過程中起什么作用，是通過何種途徑實(shí)現(xiàn)，成為闡明MWCNTs致胸膜間皮瘤分子機(jī)制的關(guān)鍵問題。但目前對慢性炎癥

3、在MWCNTs致胸膜間皮瘤作用機(jī)制研究中，存在以下問題:(1)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均采用高劑量、一次性注射的給藥方式。MWCNTs致胸膜間皮瘤是一個(gè)長期、低劑量持續(xù)作用過程，一次性注射在暴露途徑和暴露劑量上無法模擬MWCNTs的真實(shí)暴露情況。(2)體外實(shí)驗(yàn)多采用單細(xì)胞培養(yǎng)，無法模擬胸膜腔內(nèi)的細(xì)胞環(huán)境。認(rèn)為只有基于真實(shí)暴露劑量和暴露環(huán)境的實(shí)驗(yàn)體系，才有可能闡明MWCNTs致間皮瘤的分子機(jī)制。
　　本研究采用低劑量、長期染毒的作用模式，通過人胸膜

4、間皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系探討慢性炎性反應(yīng)在MWCNTs致胸膜間皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及其分子機(jī)制，以期為納米材料從業(yè)人員的職業(yè)安全防護(hù)提供科學(xué)依據(jù)，為間皮瘤的治療提供新的思路和借鑒。
　　方法:
　　本實(shí)驗(yàn)分為四組，人胸膜間皮細(xì)胞組、巨噬細(xì)胞+人胸膜間皮細(xì)胞組、MWCNTs+人胸膜間皮細(xì)胞組和MWCNTs+巨噬細(xì)胞+人胸膜間皮細(xì)胞組;MWCNTs的終濃度為0.1μg/mL;作用時(shí)間為3個(gè)月;利用以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究:

5、　　1.通過掃描電鏡和透射電鏡來考察受試MWCNTs的纖維特征是否符合“病理性纖維”的前提條件;
　　2.通過比較不同組別間細(xì)胞因子的表達(dá)量變化，考察MWCNTs是否能誘導(dǎo)炎性反應(yīng)以及間皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間的相互作用;
　　3.通過細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲、克隆形成實(shí)驗(yàn)、染色體畸變實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn)，考察炎性細(xì)胞在MWCNTs致人胸膜間皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用;
　　4.通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選MWCNTs致人胸膜間皮

6、細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中相關(guān)候選基因;并用qRT-PCR及western blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)對候選基因進(jìn)行驗(yàn)證，提出可能的分子作用機(jī)制;
　　5.構(gòu)建候選基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲低的胸膜間皮細(xì)胞株，在MWCNTs作用下與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，通過比較不同組別之間細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、克隆形成能力，考察候選基因在MWCNTs致間皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用;
　　6.構(gòu)建候選基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲低的間皮細(xì)胞株，通過western blot技術(shù)檢測候選基因敲除的間皮細(xì)胞+

7、MWCNTs+巨噬細(xì)胞體系中間皮細(xì)胞的蛋白表達(dá)含量，確定基因之間相互作用關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　通過以上實(shí)驗(yàn)，得到了如下結(jié)果:
　　1.本實(shí)驗(yàn)所用的MWCNTs平均長度范圍為10-20μm，管徑范圍為30-50nm，符合病理性纖維的特征。
　　2.MWCNTs作用于巨噬細(xì)胞可引起IL-1β細(xì)胞因子表達(dá)的顯著改變;巨噬細(xì)胞與間皮細(xì)胞之間存在密切聯(lián)系:MWCNTs作用于巨噬細(xì)胞所分泌的IL-1β能顯著增強(qiáng)間皮細(xì)胞IL

8、-8、TNF-α和IL-6等炎性因子的釋放。
　　3.在低劑量MWCNTs的長期作用下，體外培養(yǎng)的間皮細(xì)胞染色體畸變增加;MWCNTs+巨噬細(xì)胞+間皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，間皮細(xì)胞染色體畸變率均高于其它組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;此結(jié)果表明，低劑量的MWCNTs體外長期作用于間皮細(xì)胞可使其染色體畸變有增加的趨勢，巨噬細(xì)胞可能對MWCNTs致染色體畸變效應(yīng)具有促進(jìn)作用;
　　4.在低劑量MWCNTs的長期作用下，體外培養(yǎng)的間皮細(xì)胞發(fā)生

9、惡性轉(zhuǎn)化;MWCNTs+巨噬細(xì)胞+間皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，間皮細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和克隆形成能力均明顯高于其它組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;此結(jié)果表明:巨噬細(xì)胞對MWCNTs致間皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化作用具有明顯的促進(jìn)作用。
　　5.皮下接種MWCNTs+巨噬細(xì)胞+間皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系中間皮細(xì)胞的裸鼠，其腫瘤體積和成瘤組織中細(xì)胞的Ki67陽性率明顯高于其它組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;此結(jié)果提示與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后的間皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化程度更高。
　　

10、6.通過轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出一系列差異表達(dá)基因;結(jié)合前部分的研究結(jié)果，認(rèn)為其中NF-κB(p65)，IL-6，STAT3基因與MWCNTs致間皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化關(guān)系最為密切;qRT-PCR及western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MWCNTs+巨噬細(xì)胞+間皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系中間皮細(xì)胞的NF-κB(p65)，IL-6，STAT3基因和蛋白質(zhì)表達(dá)量均明顯升高，與其他組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示:NF-κB(p65)，IL-6，STAT3基因

11、在MWCNTs致胸膜間皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。
　　7.間皮細(xì)胞(sh-p65or sh-IL-6R or sh-STAT3)+MWCNTs+巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，間皮細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和克隆形成能力均明顯低于間皮細(xì)胞(sh-NC)+MWCNTs+巨噬細(xì)胞組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;此結(jié)果證明，NF-κB、IL-6、STAT3在MWCNTs致胸膜間皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。
　　8.間皮細(xì)胞(sh-NC or sh-p

12、65or sh-IL-6R or sh-STAT3)+MWCNTs+巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，敲低NF-κB(p65)后，IL-6、STAT3蛋白水平表達(dá)量均降低;敲低IL-6R后，NF-κB蛋白水平表達(dá)量不變，STAT3蛋白表達(dá)量降低;敲低STAT3后，NF-κB(p65)、IL6R蛋白表達(dá)量均不變。此結(jié)果表明在MWCNTs致胸膜間皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中存在NF-κB/IL-6/STAT3分子級聯(lián)，且NF-κB/IL-6/STAT3通路具有重

13、要作用。
　　結(jié)論:
　　通過上述研究，得出了以下結(jié)論:
　　1.MWCNTs刺激巨噬細(xì)胞所分泌的以IL-1β為主的細(xì)胞因子能顯著增強(qiáng)間皮細(xì)胞炎性因子的釋放;
　　2.在低劑量MWCNTs的長期作用下，體外培養(yǎng)的人胸膜間皮細(xì)胞可發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化;
　　3.炎性反應(yīng)可顯著促進(jìn)MWCNTs致人胸膜間皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化作用
　　4.NF-κB/IL-6/STAT3分子通路在炎性反應(yīng)促M(fèi)WCNTs致人胸膜間皮細(xì)胞的