IL5 調(diào)節(jié)肝再生的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、肝臟是機(jī)體的“生化工廠”，每時每刻都發(fā)生著各種生化反應(yīng)，如營養(yǎng)物質(zhì)的合成與儲存、血清蛋白的分泌、毒素以及代謝物的降解等。由于肝臟特殊的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，其經(jīng)常受到各種化學(xué)物質(zhì)以及病原體的損傷。肝臟具有強(qiáng)大的再生能力，可以通過代償性增生恢復(fù)原有的結(jié)構(gòu)與功能。肝再生的調(diào)控精密而復(fù)雜，涉及多種組織損傷修復(fù)分子，如補(bǔ)體系統(tǒng)、血小板、炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）、生長因子（HGF、EGF、VGF）和抗炎因子（IL-10、TGF-β）

2、；多種細(xì)胞，如肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞、星狀細(xì)胞；多個生命活動，如增殖、分化、凋亡、代謝等等；是一個魯棒性極強(qiáng)的生物學(xué)過程。對肝再生的研究一方面可以為臨床上肝切除、肝移植以及人工肝等治療提供理論支持，為肝病的轉(zhuǎn)歸提供判斷依據(jù)；另一方面也可以為研究細(xì)胞的生長調(diào)控、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、以及器官的發(fā)育等重要科學(xué)問題提供重要模型。
　　在所有哺乳動物中，組織損傷均伴隨著機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活，臨床上，肝再生也往往與肝臟急、慢性炎癥損傷同

3、時存在，這意味著免疫系統(tǒng)可能在組織損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)室前期檢測了肝切除后不同時間點(diǎn)肝臟內(nèi)單個核細(xì)胞各亞群的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)肝切除后4 h和168 h肝臟內(nèi)CD3+、CD3+CD4+CD8-、CD3+CD4-CD8+細(xì)胞數(shù)量顯著上升，這提示T細(xì)胞可能參與肝再生過程。隨后我們觀察了T細(xì)胞缺陷裸小鼠（BALB/c NUDE-athymic mice）70％肝切除后7天內(nèi)的肝再生能力變化，發(fā)現(xiàn)裸小鼠相較于對照小鼠肝再生過程中肝重的恢復(fù)發(fā)

4、生了明顯延緩，同時我們通過檢測BrdU滲入率以及PCNA與p-HDAC3的表達(dá)發(fā)現(xiàn)裸小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的增殖高峰晚于對照小鼠，這表明T細(xì)胞缺陷裸小鼠的肝再生進(jìn)程發(fā)生了延遲。
　　細(xì)胞因子在肝再生調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多參與肝再生的調(diào)控因子，但肝再生是一個魯棒性很強(qiáng)的生物學(xué)過程，通常缺失一個基因并不會使肝再生完全停止。我們利用多因子免疫檢測技術(shù)分析了小鼠肝切除后不同時間點(diǎn)血清中細(xì)胞因子的變化，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期積累的小鼠肝切

5、除后不同時間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，一方面驗(yàn)證了目前對肝再生的部分認(rèn)識，如TNF-α及其下游通路參與肝再生啟動，另一方面發(fā)現(xiàn)了新的可能參與肝再生的新的細(xì)胞因子及其下游通路，如IL-5。多因子免疫檢測技術(shù)結(jié)果顯示肝切除后血清中IL-5水平變化的幅度顯著，轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析顯示IL-5下游靶基因在肝切除后不同時間點(diǎn)的變化趨勢與IL-5一致。此外，肝再生也能誘導(dǎo)肝臟中IL-5蛋白及mRN A水平、IL-5受體IL-5Rα及CSF2RB的蛋白及

6、mRNA水平的顯著增加，提示IL-5可能參與肝再生調(diào)控。
　　我們發(fā)現(xiàn)小鼠在外源注射IL-5可以促進(jìn)70%肝切除小鼠肝臟再生過程，表現(xiàn)為：肝臟體重比恢復(fù)增快，BrdU滲入水平增強(qiáng)，p-HDAC3、PCNA、CyclinA、CyclinB1、CyclinD1、CyclinE1表達(dá)增強(qiáng)。另外，我們通過小分子抑制劑YM90709抑制IL-5與其受體的相互作用，從而阻斷其生物學(xué)效應(yīng)，我們發(fā)現(xiàn)注射YM90709后，肝切除小鼠BrdU滲入水平

7、降低，p-HDAC3和PCNA的表達(dá)減弱，但肝重體重恢復(fù)未受影響。另外我們通過注射Anti-IL5中和小鼠體內(nèi)IL-5，同樣發(fā)現(xiàn)Anti-IL5可以抑制肝切除小鼠肝再生能力。為探討IL-5促進(jìn)肝再生的機(jī)制，我們利用兩步灌流法分離并體外培養(yǎng)小鼠原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，我們分別用不同濃度的IL-5進(jìn)行刺激，利用EdU滲入的方法我們檢測到IL-5刺激后EdU陽性細(xì)胞比例隨IL-5濃度升高而增加，這說明IL-5在體外可以明顯地刺激肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞DNA的合成

8、。同時我們檢測了部分增殖相關(guān)通路中重要分子的磷酸化水平，包括JAK/STAT通路中的JAK1和STAT3、Ras/ERK通路中的ERK、PI3K/AKT通路中的AKT、p38MAPK通路中的p38，發(fā)現(xiàn)這些信號分子發(fā)生了活化，這提示我們IL-5可能通過這些通路促進(jìn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的增殖。由于有研究報道嗜酸性粒細(xì)胞可以通過分泌IL-4調(diào)節(jié)肝再生，且IL-5參與嗜酸性粒細(xì)胞的活化，我們檢測了注射IL-5對肝切除后肝臟中嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶（EP

9、X）以及IL-4的含量，發(fā)現(xiàn)外源注射了IL-5的小鼠肝臟中EPX和IL-4的含量均有所升高，這提示我們IL-5促進(jìn)肝再生可能也依賴于嗜酸性粒細(xì)胞的途徑。
　　綜上所述，我們以小鼠70%肝切除為模型，利用所收集的切除后不同時間點(diǎn)肝臟單個核細(xì)胞各亞群數(shù)量、血清細(xì)胞因子水平、肝臟轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)肝再生過程的新分子—IL-5，并利用重組蛋白、小分子抑制劑以及中和抗體深入驗(yàn)證了IL-5促進(jìn)肝再生的作用；分子和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭