人膽囊炎致病菌對(duì)豚鼠腸道屏障及其結(jié)構(gòu)蛋白的影響.pdf

1、現(xiàn)代生活中，隨著人類飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，近年來(lái)膽囊炎的發(fā)病率有增高的趨勢(shì)。對(duì)于膽囊炎的發(fā)病機(jī)制有多種假說(shuō)，細(xì)菌感染為其假說(shuō)之一。本課題組前期工作中，通過(guò)檢測(cè)臨床樣本，發(fā)現(xiàn)膽囊炎患者的膽汁中有細(xì)菌存在，并分離鑒定出一株感染性大腸桿菌Enteroinvasive Escherichia Coli(EIEC)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，口服該菌能夠使豚鼠產(chǎn)生膽囊炎。這些證據(jù)提示該菌為人類膽囊炎的致病菌。本課題旨在揭示該致病菌如何穿透腸道屏障入血的機(jī)

2、制，為最終闡明細(xì)菌性膽囊炎發(fā)病的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。本課題模擬抗生素導(dǎo)致腸道屏障受損狀態(tài)，并通過(guò)PCR-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)來(lái)鑒定該狀態(tài)的存在，然后分組處理模式動(dòng)物，一組用鼠李糖乳酸桿菌灌胃，作為陽(yáng)性對(duì)照;另一組用本實(shí)驗(yàn)室特有菌種E.coli O124 K72灌胃。最后通過(guò)PCR-DGGE電泳結(jié)果來(lái)觀察腸道菌群變化，并通過(guò)HE染色切片來(lái)觀察腸道形態(tài)學(xué)改變。研究表明，腸道病原菌可以通過(guò)改變腸道緊密連接蛋白的屏障結(jié)構(gòu)與

3、功能，使其有利于細(xì)菌的入侵和感染，從而具有操縱宿主的功能。本課題通過(guò)免疫組化來(lái)分析腸道緊密連接蛋白的表達(dá)情況，并檢測(cè)肝中，血中是否含有該致病菌，探究該致病菌是否通過(guò)消耗腸道粘液為碳源，從而突破腸道屏障入血？還是該致病菌將腸道屏障破壞，從而引起其他細(xì)菌大量入血入肝，最后入膽引起膽囊炎？
　　目的：
　　本課題旨在揭示該致病菌如何穿透腸道屏障入血的機(jī)制，為最終闡明細(xì)菌性膽囊炎發(fā)病的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。通過(guò)模擬抗生素導(dǎo)致腸道屏障

4、受損狀態(tài)，并由PCR-DGGE技術(shù)來(lái)鑒定該狀態(tài)的存在，然后分組處理模式動(dòng)物，一組用鼠李糖乳酸桿菌灌胃，另一組用本實(shí)驗(yàn)室特有菌種E.coli O124 K72灌胃。最后通過(guò)PCR-DGGE電泳結(jié)果來(lái)觀察腸道菌群變化，并通過(guò)HE染色切片來(lái)觀察腸道的形態(tài)學(xué)改變。通過(guò)免疫組化來(lái)分析腸道緊密連接蛋白的表達(dá)情況，并檢測(cè)肝中，血中是否含有該致病菌，探究該致病菌是否通過(guò)消耗腸道粘液為碳源，從而突破腸道屏障入血？還是該致病菌將腸道屏障破壞，從而引起其他細(xì)

5、菌大量入血入肝，最后入膽引起膽囊炎？
　　方法：
　　1、采用抗生素給動(dòng)物灌胃，以提高感染性大腸桿菌的感染效果。抗生素左氧氟沙星按照規(guī)定計(jì)量給兩組豚鼠灌胃10天，分別在不同天數(shù)收集豚鼠糞便。并用試劑盒對(duì)糞便總DNA進(jìn)行提取。然后利用PCR-DGGE(Denaturing GradientGel Electrophoresis，變性梯度凝膠電泳)對(duì)上述糞便DNA進(jìn)行分離分析，觀察其多樣性的變化，以及整體趨勢(shì)，確定腸道菌群失衡。

6、并選擇感興趣的條帶進(jìn)行切膠回收，構(gòu)建克隆載體，鑒定菌種等。
　　2、通過(guò)灌胃方式將從急性膽囊炎患者膽汁中分離獲得的致病菌接種到豚鼠體內(nèi)，并通過(guò)特異性引物檢測(cè)豚鼠血清中是否含有該致病菌，肝臟組織研磨液中是否含有該致病菌。
　　3、通過(guò)病理切片觀察其對(duì)豚鼠腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，以確定損傷。利用IHC技術(shù)來(lái)檢測(cè)腸道上皮細(xì)胞封閉蛋白Occludin和緊密連接蛋白Claudin2的表達(dá)情況，對(duì)比各組之間的變化，來(lái)研究豚鼠的腸屏障功能是否

7、遭到破壞。探索該致病菌是通過(guò)哪些途徑對(duì)膽道系統(tǒng)造成影響的。
　　4、利用real-time PCR在mRNA水平檢測(cè)不同處理組間，腸道粘液分泌相關(guān)蛋白的基因表達(dá)情況，探討腸道屏蔽損傷機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.PCR-DGGE（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，變性梯度凝膠電泳），結(jié)果顯示，抗生素處理不同天數(shù)腸道菌群多樣性呈遞減趨勢(shì)。
　　2.測(cè)序結(jié)果顯示抗生素處理過(guò)

8、后，益生菌種類減少，致病菌種類增加，其中Bifidobacterium magnum（雙歧桿菌）在抗生素處理三天后顯著減少;Desulfotomaculum thermocistemum（脫硫腸狀菌屬）的菌量隨著抗生素處理天數(shù)的增加呈現(xiàn)遞減趨勢(shì);Streptococcus constellatus（星座鏈球菌）在正常組沒(méi)有，隨著抗生素給藥天數(shù)增加，該菌逐漸出現(xiàn)。此外還檢測(cè)出DesulFovibrio(脫硫弧菌)，Hyphomonas n

9、eptunium(生絲單胞菌屬)，Tetragenococcus halophilus subsp.Halophilus(嗜鹽四聯(lián)球菌)等。
　　3.Real-time PCR結(jié)果顯示.Anti+E.coli組，粘液分泌相關(guān)蛋白Muc13，Muc15，Muc1，基因表達(dá)水平較正常組和益生菌組顯著增加。
　　4.E.coli O124 K72侵染豚鼠實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，大腸桿菌灌胃組（Anti+E.coli），其病理切片顯示結(jié)腸壁

10、內(nèi)大量空泡組織，顯示高腳杯細(xì)胞增生，并伴有輕度炎癥。
　　5.免疫組化顯示益生菌組(Anti+LGG) Claudin-2含量較正常對(duì)照組(CG)有所增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而Anti+E.coli組Claudin-2含量較正常組顯著增加(P＜0.05)。Occludin表達(dá)量與上一組結(jié)果正好相反。
　　6.將各組肝臟組織研磨液進(jìn)行培養(yǎng)，并設(shè)計(jì)E.coli O124 K72的特意性引物，對(duì)菌液進(jìn)行特異性擴(kuò)增，但并未檢測(cè)出肝臟中

11、有該致病菌存在，同理血清中也沒(méi)有該致病菌，但是益生菌組的肝臟研磨液中發(fā)現(xiàn)一種益生菌存在，Bacillustoyonensis。
　　結(jié)論:
　　1、本課題采用PCR-DGGE（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,變性梯度凝膠電泳）對(duì)抗生素處理過(guò)的模式動(dòng)物糞便細(xì)菌總DNA進(jìn)行定性、半定量分析，觀察腸道菌群整體變化趨勢(shì)。比較抗生素處理過(guò)和正常組腸道菌群組成的差異，系統(tǒng)全面的揭示抗生素對(duì)

12、腸道菌群的破壞，確定造模成功。
　　2、Real-time PCR結(jié)果顯示.Anti+E.coli組，粘液分泌相關(guān)蛋白Muc13，Muc15，Muc1基因表達(dá)水平較正常組和益生菌組顯著增加。說(shuō)明腸道長(zhǎng)期遭受致病菌侵襲，不但其結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，基因水平上也會(huì)有變化，而且這幾種粘液分泌蛋白表達(dá)增高，也說(shuō)明腸道的一種炎癥癥狀，大量分泌粘液，是腸道對(duì)抗外界刺激的一種自我保護(hù)。
　　3、免疫組化的結(jié)果顯示，E.coli(O124 K72