解脲脲原體Ferritin蛋白和MsrA蛋白抗氧化功能及其機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：解脲脲原體（Ureaplasma urealyticum，Uu）是能在體外培養(yǎng)的最小的原核細(xì)胞型微生物之一。Uu是人類泌尿生殖道一種常見的病原體，除了與尿道炎、前列腺炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和盆腔炎等疾病密切相關(guān)外，Uu感染還可導(dǎo)致精子尾部缺陷、活動(dòng)力下降及精子內(nèi)活性氧上升，從而可能導(dǎo)致男性不育?；钚匝踝杂苫╮eactive oxygen species，ROS）是生物機(jī)體正常有氧代謝中不可避免的副產(chǎn)物，人巨噬細(xì)胞能夠利用ROS以

2、殺傷入侵的病原菌。為了能夠在機(jī)體內(nèi)存活，病原菌在進(jìn)化過程中形成了多種機(jī)制來抵抗ROS引起的損傷。Uu在定植過程中不可避免會(huì)遭遇過氧化傷害，因此，抗氧化能力對(duì)于Uu的存活及其致病性至關(guān)重要。迄今為止，Uu的抗氧化作用機(jī)制仍不清楚。本文旨在通過研究Uu鐵蛋白（Ferritin）和蛋氨酸亞砜還原酶（MsrA）的抗氧化功能及其作用機(jī)制，為闡明Uu的抗氧化作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.按照200∶1的比例將Uu與THP-

3、1細(xì)胞分別共孵育3h、6h、12h和24h，取細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入DCFH-DA以測(cè)定ROS含量。
　　2.利用生物信息學(xué)方法分析Uu的Ferritin和MsrA的編碼基因。
　　3.分別用H2O2、異丙苯基過氧化氫（Cumene hydroperoxide，CHP）和叔丁基氫過氧化物（t-BHP）脅迫Uu20min、40min和60min，熒光定量PCR測(cè)定脅迫條件下Ferritin和MsrA基因的表達(dá)情況。
　　4.

4、PCR擴(kuò)增Ferritin和MsrA基因片段，將其分別連接到表達(dá)載體pET28a以獲得重組載體pET28a-Ferritin和pET28a-MsrA，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21，用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，并經(jīng)Ni2+親和層析柱純化目的蛋白。
　　5.利用固相親和層析法和內(nèi)源熒光法測(cè)定Ferritin蛋白和Fe2+的結(jié)合情況；用分光光度法測(cè)定Ferritin蛋白的促鐵氧化動(dòng)力學(xué)曲線；并用體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定Ferritin蛋白的

5、抗氧化能力；用凝膠阻滯法檢測(cè)Ferritin蛋白與DNA的結(jié)合能力及其保護(hù)DNA的功能。
　　6.將Ferritin基因連接到表達(dá)載體pTrc99a構(gòu)建pTrc99a-Ferritin重組載體，將其轉(zhuǎn)化入氧化敏感型大腸桿菌突變株（Δdps，JW0797-1），分別測(cè)定重組菌和對(duì)照菌在氧化脅迫下的存活率。
　　7.分光光度法測(cè)定重組Uu MsrA蛋白將Met-O還原為Met的功能。
　　8.將MsrA基因連接到pTrc9

6、9a以獲得pTrc99a-MsrA重組載體，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌突變體（ΔMsrA，JW4178-3），測(cè)定該重組菌和對(duì)照菌在不同氧化脅迫下的存活率。
　　結(jié)果：
　　1.Uu感染能夠誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生ROS。
　　2.經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析，發(fā)現(xiàn)Uu基因組中含有一個(gè)Ferritin和MsrA基因。
　　3.Ferritin基因在H2O2脅迫20、40或60min后，F(xiàn)erritin基因的表達(dá)量分別上調(diào)了3.5倍

7、、4.4倍和5.1倍；在經(jīng)過CHP脅迫20、40或60min后，F(xiàn)erritin基因的表達(dá)量都上調(diào)了4倍；在經(jīng)t-BHP脅迫20、40或60min后，基因表達(dá)量則分別上調(diào)了2.4倍、3.2倍和3.1倍。Uu MsrA基因在H2O2脅迫20、40或者60min時(shí)，MsrA基因的表達(dá)量分別上調(diào)了4.5倍、6倍和6倍；在經(jīng)CHP脅迫20、40或者60min時(shí)，其表達(dá)量都上調(diào)了11倍，而在經(jīng)t-BHP脅迫時(shí)則分別上調(diào)了3倍、3.5倍和4倍。

8、r>　　4.成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET28a-Ferritin和pET28a-MsrA，用IPTG分別誘導(dǎo)含有重組載體的重組菌表達(dá)了分子量約為22kDa的重組Ferritin蛋白和分子量約為21kDa的重組MsrA蛋白，經(jīng)親和層析后獲得了純化的重組Ferritin蛋白和MsrA蛋白。
　　5.Ferritin蛋白能夠結(jié)合Fe2+離子，F(xiàn)e2+離子能使Ferritin蛋白的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度降低；重組Uu Ferritin蛋白具有亞鐵

9、氧化酶功能，可將Fe2+氧化成Fe3+；Ferritin蛋白具有抗氧化功能，其IC50值明顯低于BSA蛋白的IC50值（p＜0.05）。H2O2和Fe2+可以誘導(dǎo)Ferritin蛋白與DNA結(jié)合，并且Ferritin蛋白能夠阻止DNA受到氧化損傷。
　　6.與對(duì)照組（轉(zhuǎn)化pTrc99a空載體）相比，轉(zhuǎn)化pTrc99a-Ferritin突變株的大腸桿菌對(duì)氧化應(yīng)激表現(xiàn)為高耐受性（p＜0.05）。
　　7.MsrA蛋白具有將Met

10、O還原為Met的能力。
　　8.轉(zhuǎn)化了MsrA基因的ΔMsrA大腸桿菌突變體獲得了氧化應(yīng)激耐受力。
　　結(jié)論：
　　1.氧化應(yīng)激能夠上調(diào)Uu Ferritin基因的表達(dá)；Uu Ferritin蛋白具有Fe2+結(jié)合特性及亞鐵氧化活性；Fe2+和H2O2能夠誘導(dǎo)Ferritin與DNA發(fā)生結(jié)合，并且能夠保護(hù)DNA免受氧化損傷；Uu Ferritin蛋白在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)都具有抗氧化能力，F(xiàn)erritin蛋白在Uu的抗氧化脅迫