原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞異質(zhì)性和生物學(xué)特性初步研究.pdf

1、目的：
　　我們描述并且比較兩種不同方法獲得微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain micro-vascularendothelial cells，BMECs)的方法;其目的是為了展現(xiàn)出不同方法獲得微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性，以及探討這兩種方法在細(xì)胞生成上是否存在不同。
　　材料和方法：
　　一、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代提取和培養(yǎng)
　　一種方法用機(jī)械和酶分解的方法處理腦組織，主要涉及密度離心和免疫磁珠純化等步驟，另一種方法包括

2、機(jī)械分離，兩次酶消化，20％BSA和percoll離心，加入完全培養(yǎng)基:高糖DMEM、20％PDS、4ug/mL嘌呤霉素（僅應(yīng)用2天）、100ug/mL肝素、4ng/mL bFGF、10ug/mL內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)支持物、2mM L一谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100ug/mL鏈霉素以及0.25ug/mL兩性霉素B。12小時(shí)后首次換液以去除未貼壁的細(xì)胞及血管段;放入37℃，5％CO2孵箱，每隔兩天換液一次。
　　二、蛋白免疫印跡分析

3、
　　用刮刀將BMECs混成，溶于勻漿，溶于PBS以1000R離心5min。棄上清后加入裂解液，細(xì)胞溶液放置于冰上10min，震蕩1min后，15000g離心5min。收集上清，采用BCA試劑盒測(cè)試濃度。上樣后，跑膠，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉2小時(shí)。 TBST洗膜3次(10min/次)，一抗孵育過(guò)夜，第二天辣根過(guò)氧化物酶孵育后上機(jī)發(fā)光。
　　三、免疫熒光
　　當(dāng)BMECs長(zhǎng)滿后，去除培養(yǎng)基，溶于1xPBS沖洗3次。預(yù)冷1

4、00％乙醇被用作兔抗大鼠血管第八因子抗體;固定30分鐘，4％多聚甲醛用于固定兔抗大鼠Claudin-5固定劑，室溫下固定30min。PBS沖洗3次后，0.1％Triton X-100細(xì)胞膜打孔5min，PBS清洗后加入5％BSA室溫封閉30min。一抗用1％BSA封閉后在4℃下孵育過(guò)夜。熒光二抗（FITC異硫氰酸熒光素山羊抗兔IgG，TRITC四乙基若丹明異硫氰酸鹽山羊抗兔IgG）用1％BSA(包含DAPI苯基吲哚/藍(lán)色熒光5μg/ml

5、)稀釋并且樣品在37℃避光孵育半小時(shí)。
　　四、體外血腦屏障的建立及通透性
　　通過(guò)Millicell-ERS（電阻系統(tǒng)）得到的3天的初級(jí)電鍍來(lái)評(píng)估TEER。當(dāng)BMECs聚集時(shí)，1μM熒光素鈉的DMEM加入到Transwell系統(tǒng)的上面。計(jì)根據(jù)下層小室熒光鈉的吸光度，計(jì)算出單層BMECs的通透性。
　　五、細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)定
　　將細(xì)胞放入有含有Fluo-3/AM(10μmol/ml)的DMEM中避光30分鐘，孵育

6、后用ACSF沖洗掉過(guò)多的Fluo-3/AM。BK刺激后細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化采用在共聚焦顯微鏡下在激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為505nm的數(shù)值下進(jìn)行測(cè)量，F(xiàn)0為細(xì)胞靜息狀態(tài)下的熒光變化，△F為變化后的數(shù)值與靜息狀態(tài)下的數(shù)值的比值，整個(gè)細(xì)胞的鈣離子變化為％△F/F0。
　　結(jié)果：
　　最終的的細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮的特殊抗原(von willebrand fact和claudine-5)，跨內(nèi)皮電阻(trans-endothelial

7、electrical resistance，TEER)，熒光蛋白滲透性和細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化的測(cè)量來(lái)測(cè)定鑒定。最后我們從原代細(xì)胞中獲得了兩種生物學(xué)特性的細(xì)胞并且經(jīng)過(guò)鑒定均為微血管內(nèi)皮細(xì)胞，這兩種內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、生態(tài)學(xué)特性、跨內(nèi)皮電阻、應(yīng)用緩激肽后的反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞的屏障作用均有所差異。
　　結(jié)論：
　　緩激肽10-5M觸發(fā)原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子波，細(xì)胞外鈣離子是鈣離子峰的前提和必要條件:此鈣離子波屬于鈣觸發(fā)鈣離子釋放機(jī)制。