姜黃素抑制MT1-MMP表達對乳腺癌MCF-7細胞增殖和侵襲的影響及淋巴管生成作用的研究.pdf

1、目的:
　　乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率約占女性所有惡性腫瘤的30％，致死率居女性惡性腫瘤第二位。姜黃素是一種新型的抗腫瘤藥物，近年來研究發(fā)現(xiàn)它對乳腺癌等許多惡性腫瘤均有抑制作用。有研究表明，膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(membrane type-1matrix metalloproteinase，MT1-MMP)與乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而姜黃素與MT1-MMP的關(guān)系鮮有報道。因此，本研究選擇MCF-7細胞株構(gòu)建過表

2、達MT1-MMP的乳腺癌細胞模型，研究姜黃素對乳腺癌MCF-7細胞MT1-MMP表達及淋巴管生成作用的影響，為其應(yīng)用于乳腺癌的治療提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.淋巴內(nèi)皮細胞收集和培養(yǎng)
　　收集常規(guī)包皮環(huán)切術(shù)的包皮組織，分離消化后在內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(EBM)培養(yǎng)，用Dil-ac-LDL標記淋巴內(nèi)皮細胞，加入磁珠包被人源性LYVE-1抗體和免疫磁珠，利用磁珠收集器進行收集，用DNA酶消化后使淋巴內(nèi)皮細胞與磁珠分離，淋巴

3、內(nèi)皮細胞培養(yǎng)于基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)皿的內(nèi)皮培基中，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
　　2.表達MT1-MMP的MCF-7細胞株的建立
　　將MT1-MMP基因克隆至真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1，經(jīng)測序鑒定后，用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入乳腺癌細胞MCF-7，轉(zhuǎn)染2天后，改用含G418的培養(yǎng)基篩選出能夠穩(wěn)定表達MT1-MMP的MCF-7細胞。試驗分以下三個組:未轉(zhuǎn)染組、空白質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染組。即①MCF-7對照組;②M

4、CF-7+pcDNA3.1空白質(zhì)粒組;③MCF-7/MT1-MMP轉(zhuǎn)染組，試驗時加入不同濃度姜黃素處理。
　　3.Western Blot檢測試驗組和對照組乳腺癌MCF-7細胞中MT1-MMP蛋白的水平;
　　4.分別用CCK8和Transwell測定不同濃度姜黃素對乳腺癌MCF-7細胞增殖和侵襲能力的影響;
　　5.乳腺癌MCF-7細胞株和淋巴內(nèi)皮細胞聯(lián)合三維培養(yǎng)
　　將淋巴內(nèi)皮細胞培養(yǎng)于基質(zhì)膠(Matrige

5、l)包被的培養(yǎng)皿，待細胞生長至3/4融合后，覆蓋一層M199培養(yǎng)基配制的無細胞Matrigel;膠原聚合后，在其上覆蓋一層乳腺癌細胞株Matrigel。最表面再覆蓋一層內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基。在三維培養(yǎng)過程中，待細胞生長至對數(shù)生長期加入姜黃素處理。
　　統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS21.0軟件完成，計量資料以x±s表示，多組數(shù)據(jù)參數(shù)間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用兩樣本SNK檢驗分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:<

6、br>　　1.MT1-MMP蛋白在乳腺癌MCF-7細胞中的表達
　　Western Blot實驗結(jié)果顯示，在未轉(zhuǎn)染組及空白質(zhì)粒組未見明顯蛋白表達條帶，而在轉(zhuǎn)染組均出現(xiàn)MT1-MMP蛋白表達條帶，加入姜黃素后蛋白表達條帶變低。
　　2.姜黃素抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖和侵襲作用
　　CCK-8法和Transwell法實驗結(jié)果顯示:與未轉(zhuǎn)染組及空白質(zhì)粒組比較，轉(zhuǎn)染組的細胞增值的能力增加且細胞侵襲數(shù)目增加，即表達MT1-M

7、MP蛋白的MCF-7細胞增殖和侵襲能力明顯增強，而在經(jīng)姜黃素處理后其細胞增值能力降低且侵襲數(shù)目減少，表明其增殖和侵襲能力受到抑制，且這種抑制作用呈劑量依賴方式。
　　3.姜黃素抑制乳腺癌MCF-7細胞誘導(dǎo)的淋巴內(nèi)皮細胞增生與淋巴管生成作用
　　熒光倒置顯微鏡觀察三維培養(yǎng)中各組淋巴內(nèi)皮細胞在基質(zhì)中生長情況結(jié)果顯示:各組乳腺癌細胞都能誘導(dǎo)淋巴內(nèi)皮細胞增生并形成淋巴管狀結(jié)構(gòu)，并且轉(zhuǎn)染了MT1-MMP的誘導(dǎo)能力更強，而經(jīng)姜黃素處理后