腦出血所致內(nèi)囊神經(jīng)纖維脫髓鞘病變及其機(jī)制研究.pdf

1、腦卒中是臨床上的一種常見病和多發(fā)病，包括出血性腦卒中和缺血性腦卒中兩種亞型。在我國，出血性腦卒中約占所有腦卒中的30％。腦出血（intracerebral hemorrhge, ICH）可引起腦組織的嚴(yán)重?fù)p傷，其致死率及致殘率均較高，給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。因此，腦出血的研究一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
　　ICH不僅可以引起神經(jīng)元的損傷，也可以引起大腦白質(zhì)的損傷。白質(zhì)主要由神經(jīng)纖維構(gòu)成，神經(jīng)纖維包括了有髓纖維和無髓纖

2、維，有髓纖維包含了中央的軸突及纏繞包裹在其表面的髓鞘。研究表明，軸突和髓鞘對缺氧、興奮性毒性及物理性損傷都非常敏感，而軸突和髓鞘的損傷均可導(dǎo)致正常的神經(jīng)信息傳遞出現(xiàn)障礙，繼而引發(fā)一系列的神經(jīng)功能障礙。在臨床上，內(nèi)囊及基底節(jié)區(qū)的出血極其常見，由于內(nèi)囊區(qū)有大量重要的感覺和運(yùn)動傳導(dǎo)束通過，因此，出血后引起的軸突和髓鞘的病變均可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，如偏身性感覺障礙，偏癱，雙眼對側(cè)視野同向性偏盲等，臨床上稱之為“三偏”癥。由于內(nèi)囊區(qū)是腦出血的

3、高發(fā)區(qū)域，且出血后會導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，因此對腦出血所致的內(nèi)囊神經(jīng)纖維脫髓鞘病變及其機(jī)制進(jìn)行深入研究，具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。
　　目前對于腦出血的研究主要集中在神經(jīng)元的損傷，罕有研究涉及軸突及髓鞘的損傷，少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的形成細(xì)胞，出血導(dǎo)致的少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷必然將引起髓鞘的病變，而現(xiàn)今對少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡與腦出血后神經(jīng)纖維的脫髓鞘病變間的關(guān)系尚未見報(bào)道，為此，本實(shí)驗(yàn)擬在制作ICH動物模型的基礎(chǔ)上，

4、采用透射電鏡、免疫印跡、免疫熒光雙標(biāo)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，明確腦出血是否能導(dǎo)致內(nèi)囊神經(jīng)纖維出現(xiàn)脫髓鞘病變，研究神經(jīng)元/少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡與腦出血后神經(jīng)纖維脫髓鞘病變之間的關(guān)系，并探尋介導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的可能信號通路，以豐富對腦出血病理機(jī)制的認(rèn)識，并為腦出血的治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。
　　目的：
　　明確腦出血是否能導(dǎo)致內(nèi)囊神經(jīng)纖維出現(xiàn)脫髓鞘病變，研究神經(jīng)元/少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞凋亡與腦出血后神經(jīng)纖維脫髓鞘病變間的關(guān)系，探尋介導(dǎo)少突膠質(zhì)

5、細(xì)胞凋亡的可能信號途徑。
　　方法：
　　成年健康雄性 Sprague-Dawley大鼠，隨機(jī)分成 sham組（n=28）和模型組（n=84）。采用自體血注入法制作腦出血實(shí)驗(yàn)動物模型，sham組僅插入微量注射器，不注血，模型組又分成出血后1、3、7d三個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行觀察。運(yùn)用 mNSS評分體系對大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評估，通過透射電鏡檢測sham組及ICH后內(nèi)囊神經(jīng)纖維髓鞘的病理變化，并同時(shí)使用免疫印跡檢測ICH后內(nèi)囊區(qū)髓堿性蛋白

6、（myelin basic protein， MBP）、Active Caspase-3、Caspase-12以及Cytochrome C的表達(dá)變化。采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測ICH后內(nèi)囊區(qū)少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CNPase與Active Caspase-3、神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN與Active Caspase-3、CNPase與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑的標(biāo)志分子Caspase-12以及CNPase與線粒體途徑的標(biāo)志分子Cytochrome C的共表達(dá)。

7、
　　結(jié)果：
　　大鼠神經(jīng)功能評分結(jié)果顯示，ICH組與sham組相比較，mNSS分值明顯增高，差別具有顯著性（P<0.05），在ICH后1 d，mNSS分值達(dá)到峰值（P<0.05），從3 d開始逐漸降低，但仍高于sham組。透射電鏡的結(jié)果顯示，sham組神經(jīng)纖維及表面的髓鞘形態(tài)基本正常，髓鞘保持正常的板層結(jié)構(gòu)。從手術(shù)后1d開始，軸索開始出現(xiàn)腫脹，髓鞘發(fā)生折疊、皺縮，并且出現(xiàn)分層現(xiàn)象，表現(xiàn)出特征性的“洋蔥皮”樣外觀，同時(shí)髓鞘的

8、局部變薄、崩解，局部出現(xiàn)了髓鞘的中斷，髓鞘向神經(jīng)氈內(nèi)、外折疊，形成胞內(nèi)和胞外髓樣結(jié)構(gòu)，髓鞘的病理改變隨時(shí)間的延長而加重。免疫印跡的結(jié)果顯示，ICH組 MBP的表達(dá)明顯低于 sham組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其表達(dá)從ICH后1 d隨時(shí)間延長逐漸降低，到ICH后第7 d達(dá)到最低值（P<0.05）。少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CNPase和Active Caspase-3的免疫熒光雙標(biāo)記結(jié)果顯示，ICH各組Active Caspase-3

9、陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)比sham組明顯增多，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Active Caspase-3陽性少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)從ICH后1 d開始增多，在ICH后7 d達(dá)到最大值（P<0.05）。而神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN與Active Caspase-3的免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，ICH后1 d開始Active Caspase-3陽性的神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，在ICH后7 d達(dá)到峰值（P<0.05），ICH組Active Caspase-3陽性

10、神經(jīng)元數(shù)目與sham組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P<0.05），同時(shí)免疫印跡的結(jié)果顯示，內(nèi)囊區(qū) ActiveCaspase-3的表達(dá)從 ICH后1 d開始增加，到第7 d時(shí)達(dá)到最大值（P<0.05），ICH各組Active Caspase-3蛋白表達(dá)水平與sham組比較明顯增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P<0.05）。Caspase-12-CNPase以及Cytochrome C-CNPase免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，與sham組相比較，ICH組Ca

11、spase-12及Cytochrome C陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)明顯增多，差別具有顯著性（P<0.05），Caspase-12及Cytochrome C陽性的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間延長逐漸增多，在第7 d時(shí)達(dá)到最大值（P<0.05）。同時(shí)免疫印跡的結(jié)果顯示，內(nèi)囊區(qū)Caspase-12及Cytochrome C的蛋白表達(dá)水平從ICH后1 d開始逐漸增加，并在ICH后7 d達(dá)到峰值（P<0.05）， ICH各組Caspase-12與Cytoch