p53 在 CSCI 脫髓鞘病變中的作用及其機制研究.pdf

1、背景：脊髓壓迫性損傷（Compressed spinal cord injury，CSCI）是一組具有占位性特征的椎管內(nèi)病變，通常由黃韌帶硬化、椎骨骨折、髓內(nèi)腫瘤等造成，是神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾患。其臨床表現(xiàn)為脊髓受壓平面以下的運動、感覺、反射及括約肌功能部分或全部障礙。如果沒有解除壓迫，及時治療，將會發(fā)生不可逆的功能喪失，給患者的身體和心理帶來嚴重傷害，進而對患者的家庭和社會帶來極大的負擔。
　　髓鞘在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是由少突膠質(zhì)細胞（

2、Oligodendrocytes，OLs）形成的，它是包繞在神經(jīng)元軸突外面的一層髓磷脂膜結(jié)構(gòu)。髓鞘在神經(jīng)系統(tǒng)中起到對軸突及周圍組織的支持作用；并以“跳躍式傳導”確保動作電位準確、快速的傳遞以及在軸突受損時引導軸突再生。有研究發(fā)現(xiàn)，OLs的凋亡和脫髓鞘是CSCI最顯著的病理改變。髓鞘結(jié)構(gòu)的完整確保了動作電位的“跳躍式傳導”，所以髓鞘一旦脫失，神經(jīng)沖動的傳導必然會受到阻滯或泛化，進而影響神經(jīng)系統(tǒng)的功能，極大地降低患者的生活質(zhì)量。因此，如何減

3、少OLs的損傷，避免髓鞘的脫失，是脊髓損傷修復(fù)研究的重點領(lǐng)域之一。然而，目前有關(guān)CSCI脫髓鞘的機制尚未完全闡明，因此，進一步探討其發(fā)病機理，尋求一種有效的防止髓鞘脫失、恢復(fù)神經(jīng)沖動正常傳導的治療方法是當前一個亟待解決的問題。
　　為此，本實驗擬在制作CSCI動物及細胞模型的基礎(chǔ)上，采用透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM），免疫熒光染色，蛋白質(zhì)印跡（western blot），流式細

4、胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）等實驗方法，重點對p53在CSCI脫髓鞘病變中的作用及其機制著手進行研究，進一步闡明CSCI脫髓鞘病變的分子機制，為臨床治療提供實驗基礎(chǔ)。
　　目的：
　　1．制作模型探討p53是否在CSCI脫髓鞘病變中發(fā)揮作用。
　　2．用p53特異性抑制劑PFT-μ，對CSCI模型動物及OLs體外培養(yǎng)的細胞模型進行干預(yù)，觀察干預(yù)前后有髓神經(jīng)纖維髓鞘／OLs的變化，研究OLs凋亡與CSCI

5、脫髓鞘病變之間的關(guān)系，進一步闡明p53在脫髓鞘病變中的作用及其機制。
　　方法：
　　1．健康成年雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠63只，隨機分為正常組（n=7）、假手術(shù)組（n=7）和CSCI組。CSCI組又進一步分為CSCI1h組（n=7）、CSCI3h組（n=7）、CSCI12h組（n=7）、CSCI1d組（n=7）、CSCI3d組（n=7）、CSCI7d組（n=7）及CSCI14d組（n=7）。正常組給予常

6、規(guī)飲食，不做任何干預(yù)；假手術(shù)組僅切開椎板，不進行壓迫；CSCI組則在行椎板切除術(shù)后采用本課題組自行研制的壓迫器壓迫脊髓2h后減壓。BBB(Basso, Beattie, and Bresnahan)運動功能評分檢測損傷后1d、3d、7d、14d大鼠后肢的運動功能；鋨酸染色及TEM觀察CSCI后不同時間點大鼠有髓神經(jīng)纖維形態(tài)學改變及數(shù)量上的變化；western blot檢測CSCI后1h、3h、12h、1d、3d、7d及14d髓鞘堿性蛋白

7、（myelin basic protein，MBP），p53，E2F1，active caspase-3，caspase-12及cytochrome C的表達變化；免疫熒光三標檢測p53，E2F1，active caspase-3的共表達及caspase-12、cytochrome C與OLs表面標記物—環(huán)核苷酸磷酸二酯酶（Cyclic neucleotide phosphodiesterase，CNPase）的共表達。
　　2．

8、取SD乳鼠皮質(zhì)，采用B104條件培養(yǎng)基（the conditioned medium prepared from B104 neuroblastoma cells，B104CM）增殖培養(yǎng)結(jié)合 EDTA消化機械吹打分離純化法培養(yǎng)少突膠質(zhì)前體細胞（Oligodendrocyte progenitor cells，OPCs）。對純化后的OPCs更換分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3d，使OPCs向OLs方向分化。
　　3．通過氧糖剝奪建立CSCI細胞模型

9、，然后將OLs分為3組：正常組、CSCI細胞模型組、PFT-μ組。FCM檢測各組細胞的凋亡及線粒體膜電位的變化。western blot檢測各組細胞E2F1，active caspase-3，caspase-12及cytochrome C的表達變化；免疫熒光檢測active caspase-3在CNPase細胞中的表達及caspase-12、cytochrome C在CNPase細胞的共表達。
　　4．進一步在動物模型上證實細胞實

10、驗所得出的結(jié)論。將45只雌性SD大鼠分為假手術(shù)組（n=15）、PFT-μ組（n=15）及對照組（n=15）。BBB評分檢測CSCI后1d、3d、7d、14d各組大鼠后肢的運動功能；鋨酸染色和TEM觀察CSCI7d時各組大鼠有髓神經(jīng)纖維數(shù)量及結(jié)構(gòu)的變化；western blot檢測損傷7d后各組大鼠MBP，E2F1，active caspase-3，caspase-12及cytochrome C的表達變化；免疫熒光染色檢測各組大鼠E2F1

11、，active caspase-3的共表達及caspase-12、cytochrome C與CNPase的共表達。
　　5．用SPSS軟件對實驗結(jié)果進行處理及統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：
　　1.正常組和假手術(shù)組的SD大鼠 BBB評分均為21分，而CSCI組大鼠的BBB評分隨著壓迫損傷后時間的延長而降低，與正常組和假手術(shù)組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。鋨酸染色和TEM結(jié)果顯示：在正常組和假手術(shù)組，有髓神經(jīng)纖維在白質(zhì)

12、中均勻分布；而在CSCI組，隨著壓迫損傷后時間的延長，有髓神經(jīng)纖維出現(xiàn)水腫、崩解，并且在數(shù)量上逐漸減少（P＜0.05）。免疫熒光染色顯示：假手術(shù)組MBP的免疫反應(yīng)性高，而損傷后7d，MBP的免疫反應(yīng)性明顯降低；p53，E2F1和active caspase-3的共表達在假手術(shù)組呈散在分布，而在CSCI后7d，共表達明顯增多；caspase-12+-cytochrome C+-CNPase細胞在假手術(shù)組幾乎沒有分布，但是在損傷后7d，ca

13、spase-12+-cytochrome C+-CNPase細胞廣泛分布于脊髓的白質(zhì)。western blot結(jié)果顯示MBP的蛋白表達量在損傷后逐漸降低（P＜0.05）；p53，E2F1的蛋白表達水平在損傷后先增加后降低，但都高于正常組和假手術(shù)組（P＜0.05）；active caspase-3，caspase-12及cytochrome C的蛋白表達水平在損傷后逐漸增加（P＜0.05）。
　　2.OPCs在B104CM增殖聯(lián)合E

14、DTA消化機械吹打法培養(yǎng)后用OPC特異性抗體NG2檢測，純度達到95%以上。分化培養(yǎng)基誘導后用MBP（OLs標記物）標記細胞，純度達90%以上。
　　3.FCM檢測正常組、CSCI細胞模型組、PFT-μ組細胞的凋亡率，結(jié)果顯示CSCI細胞模型組細胞凋亡率最高，PFT-μ組細胞次之，正常組細胞凋亡很少，兩兩相比，均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。線粒體膜電位檢測顯示CSCI模型組和PFT-μ組細胞熒光強度均較正常組減弱，但細胞模型組熒

15、光強度明顯低于PFT-μ組（P＜0.05）。western blot結(jié)果顯示雖然E2F1，active caspase-3，caspase-12及cytochrome C的蛋白表達水平在CSCI模型組、PFT-μ組均較正常組高，但是在CSCI模型組升高的更為明顯（P＜0.05）。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)active caspase-3在CSCI模型組CNPase細胞中高表達，而在PFT-μ組表達較少；caspase-12+?cytochrome

16、 C+?CNPase細胞在CSCI模型組數(shù)量較多，而在PFT-μ組呈零星分布。
　　4.PFT-μ干預(yù)CSCI大鼠后，大鼠的BBB評分雖然較假手術(shù)組低，但明顯高于對照組（P＜0.05），并且有髓神經(jīng)纖維數(shù)量也較對照組增多（P＜0.05）。電鏡結(jié)果顯示：假手術(shù)組的髓鞘板層排列緊密，厚薄均一；對照組的神經(jīng)纖維髓鞘明顯水腫，髓鞘板層從神經(jīng)纖維周圍分離、剝脫甚至斷裂；PFT-μ組中雖然個別神經(jīng)纖維髓鞘板層仍有崩解，但大多數(shù)神經(jīng)纖維髓鞘形態(tài)

17、趨于正常，并且水腫程度也明顯減輕。MBP蛋白表達在PFT-μ組雖然也降低，但明顯高于CSCI組（P＜0.05）。western blot結(jié)果顯示，雖然E2F1, active caspase-3, caspase-12及cytochrome C的蛋白表達水平在PFT-μ組和對照組都升高，但在PFT-μ組的升高幅度遠遠低于對照組（P＜0.05）。E2F1和active caspase-3的共表達在PFT-μ組零散分布，而在對照組則廣泛存在

18、。caspase-12、cytochrome C陽性的CNPase細胞在PFT-μ組及假手術(shù)組的脊髓白質(zhì)里散在分布，但是廣泛分布于對照組。
　　結(jié)論：
　　1.大鼠CSCI后，發(fā)生脫髓鞘病變，致使大鼠的運動功能障礙。隨著損傷時間的延長，凋亡相關(guān)蛋白p53，E2F1，active caspase-3,caspase-12及cytochrome C的表達逐漸升高，OLs凋亡增多。
　　2.PFT-μ干預(yù)動物及細胞CSCI模