鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC17978 ChaA-Y雙組份調(diào)控系統(tǒng)的研究.pdf

1、[背景]
　　鮑曼不動(dòng)桿菌是一種專性需氧的非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，其分布廣泛，是一種臨床重要的機(jī)會(huì)致病菌。目前國內(nèi)外大多數(shù)研究集中在該菌的分類學(xué)、流行病學(xué)、在臨床患者中的感染以及耐藥機(jī)制，而對(duì)其生理及應(yīng)激機(jī)制的研究報(bào)道不多。事實(shí)上，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生理及應(yīng)激機(jī)制的研究是非常重要的，這些基礎(chǔ)研究結(jié)果，將有助于研究者更好的分析和探討鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制、感染機(jī)制等關(guān)注熱點(diǎn)。
　　鮑曼不動(dòng)桿菌具有極強(qiáng)的適應(yīng)環(huán)境的能力（如耐受干燥、可變的

2、生長(zhǎng)需求、生物被膜形成以及群體感應(yīng)活性等），這使其在自然環(huán)境甚至醫(yī)院環(huán)境中廣泛分布且可以長(zhǎng)期存活。雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在鮑曼不動(dòng)桿菌的環(huán)境適應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其作為一種將環(huán)境改變與細(xì)胞生理改變相偶聯(lián)的策略，是細(xì)菌感應(yīng)外界環(huán)境變化并做出反應(yīng)的重要途徑。已有研究表明，鮑曼不動(dòng)桿菌中的雙組份調(diào)控系統(tǒng)與細(xì)菌的藥物敏感性、動(dòng)力、生物被膜形成能力、菌體形態(tài)、毒力等密切相關(guān)。
　　通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC17978基因組中

3、的AUO97_RS03045基因產(chǎn)物具有四個(gè)組氨酸磷酸基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域（HPT），一個(gè)CheA類似調(diào)控結(jié)構(gòu)域和C末端的CheY類似接收結(jié)構(gòu)域；AUO97_RS03045很可能編碼一個(gè)嵌合的雙組份調(diào)控系統(tǒng)元件，參與鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC17978的趨化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。ChA蛋白所屬趨化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在其他菌種中的研究結(jié)果顯示其與細(xì)菌的動(dòng)力相關(guān)。大腸桿菌中ChA同源蛋白為CheA，在銅綠假單胞菌中為ChpA，我們將鮑曼不動(dòng)桿菌中的相應(yīng)嵌合蛋白命名為C h

4、a A/Y。該系統(tǒng)在大腸桿菌中通過調(diào)控鞭毛的旋轉(zhuǎn)方向控制動(dòng)力，在銅綠假單胞菌中則通過調(diào)控IV型菌毛的生物合成及（或）菌毛回縮而參與調(diào)控細(xì)菌的動(dòng)力表型。至今在鮑曼不動(dòng)桿菌中未見該系統(tǒng)相關(guān)研究。雖然鮑曼不動(dòng)桿菌缺乏鞭毛，但其在一定條件下具備運(yùn)動(dòng)能力。鮑曼不動(dòng)桿菌的動(dòng)力形式多樣化，某些表現(xiàn)為“抽搐運(yùn)動(dòng)”（twitching），有些在濕滑的介質(zhì)表面表現(xiàn)為“滑動(dòng)”（sliding）或“群集運(yùn)動(dòng)”（swarming），還有些能在半固體瓊脂上形成“溝

5、渠”（ditching）。以往的研究表明，鮑曼不動(dòng)桿菌的動(dòng)力可能與Ⅳ型菌毛、群體感應(yīng)、藍(lán)色光傳感、鐵缺乏和1，3-二氨基丙烷相關(guān)。但直到現(xiàn)在，其運(yùn)動(dòng)的分子和遺傳基礎(chǔ)仍不明確的，甚至各種運(yùn)動(dòng)形式的定義也不統(tǒng)一。
　　[實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯
　　通過研究ChaA/Y雙組份調(diào)控系統(tǒng)在鮑曼不動(dòng)桿菌中的調(diào)控機(jī)制，以期進(jìn)一步認(rèn)識(shí)該菌的生理代謝過程，了解其一直不明確的動(dòng)力機(jī)制，也能為臨床以該系統(tǒng)為靶點(diǎn)開發(fā)新的預(yù)防及治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染策略提供實(shí)驗(yàn)依

6、據(jù)。
　　[實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果]
　　首先我們采用PCR方法驗(yàn)證了鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC17978的AUO97_RS03045(chaA/Y)、AUO97_RS03050(pilJ)、AUO97_RS03055(pilI)、AUO97_RS03060(pilH)、AUO97_RS03065(pilG)基因位于同一個(gè)操縱子上共轉(zhuǎn)錄，chaA/Y位于該操縱子的末端。利用RecAb系統(tǒng)我們構(gòu)建了鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC17978的chaA/

7、Y基因敲除株ΔchaA/Y::FRT，消除抗性盒后，僅在原chaA/Y基因位置殘余91bp的FRT位點(diǎn)序列；同時(shí)，我們利用pMM67EH質(zhì)粒構(gòu)建了chaA/Y回補(bǔ)株ΔchaA/Y::FRT-c。
　　然后，我們對(duì)野生株ATCC17978、突變株ΔchaA/Y::FRT以及回補(bǔ)株ΔchaA/Y::FRT-c的表型進(jìn)行觀察和比對(duì)，主要包括生長(zhǎng)狀態(tài)、代謝實(shí)驗(yàn)、表面動(dòng)力、生物被膜形成、培養(yǎng)上清?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHL）信號(hào)分子含量、藥敏實(shí)

8、驗(yàn)、透射電鏡鏡下形態(tài)等。表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，chaA/Y基因敲除后，突變株ΔchaA/Y::FRT的表面動(dòng)力減弱，生物被膜形成能力降低，培養(yǎng)物上清?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHL）信號(hào)分子含量減少，透射電鏡下細(xì)胞表面菌毛類似物和胞外多聚物減少。野生株與突變株相比，生長(zhǎng)狀態(tài)以及Biolog測(cè)試結(jié)果無明顯差異，對(duì)已檢測(cè)的多種抗生素耐藥性也無明顯變化，僅對(duì)卡那霉素的耐藥性增加，ΔchaA/Y::FRT的MIC值為8μg/ml，是野生株的4倍。回補(bǔ)株可以

9、部分恢復(fù)表面動(dòng)力及生物被膜表型。
　　為了明確在鮑曼不動(dòng)桿菌中受到chaA/Y基因調(diào)控的基因，我們利用RNA-sequencing以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌野生株ATCC17978與突變株ΔchaA/Y::FRT在動(dòng)力平板上生長(zhǎng)時(shí)的轉(zhuǎn)錄組差異進(jìn)行了研究分析。RNA-sequencing的結(jié)果顯示，突變株ΔchaA/Y::FRT相比野生株ATCC17978有113個(gè)基因顯著下調(diào)，80個(gè)基因顯著上調(diào)。上調(diào)基因富集在泛酸和輔酶

10、A的生物合成代謝通路，芳香族化合物降解，苯甲酸降解，淀粉和蔗糖代謝、脂肪酸的生物合成，乙苯的降解、脂肪酸代謝和氟苯降解代謝通路上。上調(diào)最為顯著的基因是：AUO97_RS16785（二磷酸核苷糖異構(gòu)酶），AUO97_RS16780（酒石酸轉(zhuǎn)運(yùn)體MFS超家族蛋白）和AUO97_RS16840（主要輔助超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）。下調(diào)基因中與動(dòng)力和被膜生成可能相關(guān)的基因是：CU菌毛（chaperone–usher pili）相關(guān)的基因簇（csuA/BA

11、BCDE，fimA，fimC，fimD），AUO97_RS06595-06630操縱子，AUO97_RS06645(abaI)。其中AUO97_RS06595-06630操縱子的轉(zhuǎn)錄水平下降最為顯著。而與Ⅳ型菌毛相關(guān)的基因未見明顯改變（以往有研究表明鮑曼不動(dòng)桿菌的“twitching”動(dòng)力與Ⅳ型菌毛相關(guān)）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果驗(yàn)證RNA-sequencing結(jié)果可靠。
　　我們通過調(diào)研文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)其中ATCC17978的AUO97_

12、RS06595-06630操縱子和AUO97_RS06645（abaI）已有明確報(bào)道和該菌的表面動(dòng)力及被膜相關(guān)。AUO97_RS06595-06630操縱子注釋為編碼一種酯肽，可能在細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)過程中充當(dāng)表面活性劑。以往的研究表明，AUO97_RS06595-06630操縱子(以往文獻(xiàn)中為A1S_0112-0119操縱子)是鮑曼不動(dòng)桿菌的生物被膜形成及運(yùn)動(dòng)中所必需的。鮑曼不動(dòng)桿菌的運(yùn)動(dòng)和被膜表型可能是通過cAMP的表達(dá)與AUO97_RS0

13、6595-06630操縱子相關(guān)聯(lián)。另外AUO97_RS06595-06630操縱子還受到abaI基因的調(diào)控。abaI基因是鮑曼不動(dòng)桿菌中唯一的自誘導(dǎo)信號(hào)分子合成酶編碼基因，編碼產(chǎn)物參與合成N-(3-hydroxydodecanoyl)-L-HSL(3-hydroxy-C12-HSL)，一種酰基高絲氨酸內(nèi)酯（AHL），是細(xì)菌密度感應(yīng)系統(tǒng)的信號(hào)分子。我們?cè)谂囵B(yǎng)基中添加人工合成的AHL信號(hào)分子，可以回復(fù)ΔchaA/Y::FRT的動(dòng)力及被膜表型

14、，這說明AHL信號(hào)分子在chaA/Y調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。
　　我們發(fā)現(xiàn)CU菌毛（chaperone–usher pili）相關(guān)的基因簇在ΔchaA/Y::FRT菌株中顯著下調(diào)。已有研究表明CU菌毛與鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜形成相關(guān)，而其與動(dòng)力的關(guān)系不明確。因此我們又構(gòu)建了鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC17978 csuE基因敲除株ΔcsuE::FRT，測(cè)序確認(rèn)突變株的csuE基因全長(zhǎng)從啟動(dòng)子到終止子完全缺失，被91bp的FRT位點(diǎn)取代，并使

15、用pABBR_MCS質(zhì)粒構(gòu)建回補(bǔ)株ΔcsuE::FRT-c。表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示csuE基因敲除后，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，突變株ΔcsuE::FRT的動(dòng)力減弱，生物被膜形成能力減低，生長(zhǎng)狀態(tài)無明顯變化；回補(bǔ)株恢復(fù)動(dòng)力及生物被膜表型。說明CU菌毛受chaA/Y調(diào)控，參與鮑曼不動(dòng)桿菌動(dòng)力過程。
　　[結(jié)論]
　　AUO97_RS03045基因是鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC17978中的一個(gè)嵌合的ChaA/Y雙組份調(diào)控系統(tǒng)元件，參與細(xì)菌的趨化信號(hào)