17-AAG在重型顱腦損傷中神經(jīng)保護(hù)及其自噬機(jī)制的研究.pdf

1、近年來，隨著經(jīng)濟(jì)和交通運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展，顱腦損傷發(fā)生率逐年增加，資料統(tǒng)計(jì)顯示顱腦損傷占全身外傷的第2位，但死亡率和致殘率均位居首位，尤其是重型顱腦損傷患者，死亡率和致殘率居高不下，總死亡率一直保持在30％～50％左右。雖然隨著國(guó)內(nèi)在顱腦創(chuàng)傷基礎(chǔ)及臨床防治研究的不斷深入，患者的救治效果顯著提高，致死及致殘率有所降低。但是，顱腦外傷領(lǐng)域內(nèi)仍存在許多尚待進(jìn)一步研究解決的課題，特別是創(chuàng)傷性腦水腫、線粒體功能障礙、遲發(fā)性神經(jīng)元損傷等問題。因此，深入研

2、究顱腦外傷后各種病理生理變化，不斷提升和改善顱腦外傷的規(guī)范化救治措施，是神經(jīng)外科醫(yī)生在本世紀(jì)的最重要任務(wù)之一。
　　創(chuàng)傷性腦水腫是重型顱腦創(chuàng)傷后最重要的繼發(fā)性病理和生理反應(yīng)，其分為血管源性腦水腫和細(xì)胞毒性腦水腫、滲透壓性腦水腫、間質(zhì)性腦水腫四類;創(chuàng)傷性腦水腫的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，在發(fā)生、發(fā)展過程中，各種因素相互影響，共同作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦外傷引起的應(yīng)激和反射的變化，是腦水腫的起始因素;神經(jīng)細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣超載在微循環(huán)障礙、腦

3、缺血與缺氧等一系列繼發(fā)性病理變化中起著關(guān)鍵作用。
　　遲發(fā)性神經(jīng)元損傷是顱腦損傷研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，包括神經(jīng)元變性壞死和凋亡等類型。我們期望在神經(jīng)元未發(fā)生不可逆損傷前，阻斷其發(fā)病過程，使得部分神經(jīng)元能恢復(fù)正常結(jié)果和功能。
　　最近研究表明，細(xì)胞凋亡和自噬參與了重型顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞的死亡和功能喪失。神經(jīng)元的凋亡在重型顱腦外傷的病理生理學(xué)方面具有重要意義。凋亡，Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡，依賴于caspase參與，具有染色體濃縮，細(xì)胞皺

4、縮，DNA片段化和凋亡小體形成等特點(diǎn)，其細(xì)胞的殘骸最終被巨噬細(xì)胞清除。自噬性細(xì)胞死亡，Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，其特征是自噬體的形成，不依賴于caspase的參與，自噬體及其內(nèi)部組件是通過自身的酶系統(tǒng)消化吸收的。它是高度保守的，它是真核細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制。自噬是近年來分子生物學(xué)研究的一個(gè)熱門話題。經(jīng)研究證實(shí)，二者在功能上存在聯(lián)系，自噬為凋亡所需，自噬通常先于凋亡，進(jìn)而啟動(dòng)凋亡;自噬抑制凋亡，保護(hù)細(xì)胞:自噬可保護(hù)細(xì)胞免于發(fā)生凋亡和壞死;自噬可以

5、向凋亡轉(zhuǎn)化，共同促進(jìn)細(xì)胞死亡。然而，對(duì)于重型顱腦損傷后，神經(jīng)元自噬作用的研究還鮮有報(bào)道。但是，許多文獻(xiàn)認(rèn)為，自噬作用在許多神經(jīng)退行性疾病中具有神經(jīng)保護(hù)的作用，包括在帕金森病和阿爾茨海默病的;自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(RAPA)可以衰減神經(jīng)元死亡后的缺血性損傷;自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)可以致敏細(xì)胞缺氧損傷。總之，自噬可能為重型顱腦損傷的救治提供一種有前景的治療策略。
　　17-烯丙胺基-17-脫甲氧基格爾德霉素(17-AAG)

6、是格爾德霉素的衍生物，毒性更小而熱休克蛋白90(HSP90)的抑制作用更強(qiáng)，是最早通過臨床Ⅰ期試驗(yàn)的熱休克蛋白90抑制劑，目前正在進(jìn)行Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)。其中，熱休克蛋白是機(jī)體在應(yīng)激（缺氧、外傷、病毒感染、紫外線照射等）狀態(tài)下合成的一組蛋白質(zhì)分子，故又稱為應(yīng)激蛋白。它在生物進(jìn)化過程中是高度保守的，并在原核及真核生物中廣泛存在。熱休克蛋白不僅是一種重要的分子伴侶蛋白，而且也是一種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的生物標(biāo)志物。熱休克蛋白在機(jī)體內(nèi)主要功能是參與維持其客

7、戶蛋白的正確折疊，使蛋白能夠形成生理功能所需的構(gòu)象，從而調(diào)控其在蛋白合成與降解平衡之間的作用，以及發(fā)揮其在蛋白定位中的作用。其中，HSP90家族是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)，得到了廣泛的關(guān)注。HSP90在細(xì)胞內(nèi)含量豐富，占總量的1％～2％。越來越多的研究表明，HSP90抑制劑可以阻止細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移信號(hào)通路中的多個(gè)位點(diǎn)，降低單一抑制某一通路時(shí)細(xì)胞容易產(chǎn)生耐藥性風(fēng)險(xiǎn)。Hsp90抑制劑的尋找正成為時(shí)下的研究熱點(diǎn)。17-烯丙胺基-17-脫甲氧基格爾德

8、霉素(17-AAG)是人類成功研制的HSP90抑制劑。有研究表明，17-AAG通過抗炎機(jī)制在阿爾茨海默氏病的動(dòng)物模型，肌萎縮側(cè)索硬化，局灶性腦缺血，脊髓損傷和TBI等疾病上發(fā)揮著神經(jīng)保護(hù)作用;特別是在大鼠sTBI模型，17-AAG可以減少出血的神經(jīng)保護(hù)作用，改善神經(jīng)行為，但其是否能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞自噬的作用一直沒有研究。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠重型顱腦損傷模型，探討17-AAG是否可以減輕腦水腫，抑制遲發(fā)性神經(jīng)

9、元損傷，激活神經(jīng)元自噬功能，從而抑制神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)元的存活。此外，我們通過自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素及自噬抑制劑3-MA，誘導(dǎo)或抑制腦皮質(zhì)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而探討自噬在神經(jīng)保護(hù)中的重要作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.采用改進(jìn)的Feeney' s自由落體硬膜外撞擊方法制各大鼠的重型顱腦損傷動(dòng)物模型;
　　2.應(yīng)用17-烯丙胺基-17-脫甲氧基格爾德霉素、3-甲基腺嘌呤、雷帕霉素等藥物處理大鼠的重型顱腦損傷模型;

10、r>　　3.濕干稱重法檢測(cè)大鼠的腦組織含水量，并對(duì)不同藥物處理的大鼠腦組織含水量進(jìn)行對(duì)比;
　　4.對(duì)重型顱腦損傷24小時(shí)后的大鼠，應(yīng)用大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分進(jìn)行評(píng)分，并對(duì)不同藥物處理的大鼠評(píng)分情況進(jìn)行對(duì)比;
　　5.使用蘇木精-伊紅(H&E)染色方法，對(duì)每1毫米的大鼠腦皮質(zhì)染色區(qū)進(jìn)行生存和死亡的神經(jīng)元計(jì)數(shù)，并對(duì)不同藥物處理的大鼠皮層神經(jīng)元存活率進(jìn)行對(duì)比;
　　6.應(yīng)用Western blot的方法，檢測(cè)重型顱腦損傷大鼠

11、24小時(shí)后腦皮層自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，并對(duì)不同藥物處理的大鼠皮層神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比;
　　7.應(yīng)用Western blot和免疫組化染色的方法，使用anti-caspase3抗體作為標(biāo)記，檢測(cè)大鼠皮層神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡水平，并對(duì)不同藥物處理的大鼠皮層神經(jīng)元凋亡情況以及caspase3表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比;
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.成功建立大鼠重型顱腦損傷動(dòng)物模型;
　　2.濕干重法評(píng)價(jià)大鼠創(chuàng)傷后24小

12、時(shí)腦水腫情況:17-AAG組與對(duì)照組比較，腦水腫含量明顯減弱;而3-MA治療組的水分含量明顯高于17-AAG組;相反，在RAPA組，腦水含量顯著降低。
　　3.大鼠顱腦創(chuàng)傷24小時(shí)后，17-AAG組較sTBI對(duì)照組神經(jīng)功能缺損明顯減少，而治療干預(yù)組神經(jīng)功能缺損相比17-AAG組升高。
　　4.在對(duì)照組中神經(jīng)元存活率為43.45±4.89％，而17-AAG組存活率為88.67±6.46％在存活。3-MA干預(yù)組神經(jīng)元存活率為(5

13、1.24±2.19％)，較17-AAG組顯著降低。
　　5.與對(duì)照組相比，17-AAG組中Beclin-1和LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)顯著升高。而在3-MA組中Beclin-1和LC3Ⅱ的蛋白表現(xiàn)剛好相反。而與17-AAG組相比，雷帕霉素組顯著增強(qiáng)了LC3Ⅱ的表達(dá)。
　　6.與對(duì)照組相比，17-AAG組可以顯著抑制Caspase3表達(dá);而3-MA組可以上調(diào)Caspase3表達(dá)，而雷帕霉素組結(jié)果相反。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　

14、1.17-AAG(10 mg/kg)能明顯減弱腦水腫的程度;雷帕霉素誘導(dǎo)自噬反應(yīng)后，腦組織水腫的程度進(jìn)一步降低;而3-MA抑制自噬反應(yīng)后，加重了腦水腫情況，并且腦水腫情況還超過了17-AAG治療干預(yù)組。
　　2.通過大鼠皮層神經(jīng)元H&E染色及大鼠行為功能評(píng)價(jià)，顯示17-AAG治療干預(yù)組減少了大鼠皮層神經(jīng)元的損傷和死亡，改善大鼠了運(yùn)動(dòng)功能的;而同樣在應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑或抑制劑后，減輕或加重了顱腦損傷，
　　3.與對(duì)照組相比，17-

15、AAG組中Beclin-1和LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)顯著升高。與17-AAG組相比，雷帕霉素組顯著增強(qiáng)了LC3Ⅱ的表達(dá)。而在3-MA組中Beclin-1和LC3Ⅱ的蛋白表現(xiàn)剛好相反。17-AAG可以誘導(dǎo)重型顱腦損傷后大鼠皮層神經(jīng)元的自噬反應(yīng)，并且這個(gè)過程中，受到自噬誘導(dǎo)劑及抑制劑的調(diào)節(jié)。
　　4.17-AAG治療干預(yù)組中大鼠皮層神經(jīng)元的Caspase3表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞凋亡水平明顯降低，從而抑制細(xì)胞死亡;雷帕霉素在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步降低了大鼠

16、皮層神經(jīng)元Caspase3表達(dá)和細(xì)胞凋亡水平，而3-MA組可以上調(diào)Caspase3表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說明了，17-AAG不僅引起Caspase3表達(dá)下調(diào)，從而抑制細(xì)胞死亡，而且有效的誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬反應(yīng)。
　　總之，大鼠重型顱腦損傷后，17-AAG可以減輕大鼠腦組織水腫，減少神經(jīng)元的死亡，改善大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。并且通過對(duì)于大鼠神經(jīng)元凋亡與自噬反應(yīng)的研究，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)17-AAG通過誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬抑制重型顱腦損傷后Caspase