消化道共生菌對結腸炎癥的影響.pdf

1、背景：結直腸癌（Colorectal Cancer,CRC）是一種常見的惡性腫瘤性疾病，也是一個由多因素引起和多階段產(chǎn)生的病癥。有關報道指出多種因素影響了結腸癌的發(fā)生發(fā)展，例如遺傳背景、環(huán)境因素、飲食習慣、精神壓力和人口老齡化等。最近研究發(fā)現(xiàn)，隨著疾病的難以治愈和炎癥的不斷加重，發(fā)生結直腸癌的風險也逐步提升。目前，人們對于結腸癌的作用機制和發(fā)病原因尚不清楚。在人類健康和疾病發(fā)展過程中，腸道菌群被認為是一種被遺忘的器官，它通過各種復雜的機

2、制維持著腸道平衡。最近有大量的研究報道表明，腸道微生物群也可以作為一種在結腸癌發(fā)生和發(fā)展中起主要作用的因素。許多學者根據(jù)高通量測序結果和動物模型構建提出了菌群在結直腸癌中發(fā)揮的作用,但由于研究的局限性，只能初步了解腸道菌群的致病機制,也局限于腫瘤在某個階段或者某些致病菌對腫瘤的影響，但是腸道菌群在結腸中的動態(tài)變化和具體機制仍待進一步探索。在這個微生物群時代，我們不僅要探索腸道菌群在結直腸癌發(fā)生中的作用機制，還應著重強調其潛在的臨床實踐意

3、義。如將基礎實驗研究結果轉變成臨床應用，將更好地體現(xiàn)腸道菌群在診斷和治療結直腸癌中的重要臨床價值。
　　目的：根據(jù)前期工作基礎和文獻報道，我們選取了幾種代表性的腸道菌：嗜酸乳桿菌pro15、肝螺旋桿菌51448、具核梭桿菌25586和產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌43860等，通過實驗探究，觀測幾種代表性腸道菌在結腸炎向結腸癌轉化過程中發(fā)揮的作用及其機制。
　　方法：
　?。?）我們利用給小鼠腹腔注射12.5 mg/kg劑量的氧化

4、偶氮甲烷（azoxymethane,AOM），并且給小鼠飲用2％葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium,DSS）水的聯(lián)合誘導作用，建立了結腸癌的小鼠模型，這個模型可以很好的模擬潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)病人的結腸炎惡性轉化為結腸癌的過程。用肝螺旋桿菌51448和嗜酸乳桿菌pro15給C57/B6小鼠灌胃后，取結腸固定，利用HE染色和組化進行組織學觀察，辨別腫瘤的惡化程度及性質。

5、　?。?）利用LPS+D-GalN構建小鼠急性肝功能損傷模型。腹腔注射LPS/GalN，按照LPS:35μL/kg，GalN:800μg/kg，每只小鼠6μL/g的劑量給藥。
　?。?）用具核梭桿菌25586和產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌43860給APC模型小鼠灌胃后，取結腸固定，利用HE染色進行組織學觀察，辨別腫瘤的惡化程度及性質。酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測白介素6（IL-6）、白介素17（IL-17）、γ干擾素（IFN-γ）、

6、白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子受體（TNF-α）等，分析兩種細菌對炎癥細胞因子的影響，從分子水平探究有關的作用機制。取小鼠腸系膜淋巴結，分別用抗小鼠的CD4、IFN-α、IL-17和FOXP3抗體進行表面marker染色和胞內因子染色，通過流式細胞技術檢測不同組小鼠腸道內促炎和抗炎反應水平。取小鼠腹腔巨噬細胞分別與具核梭桿菌25586和產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌43860的體外共培養(yǎng)實驗，分別用62.5×106cfu、31.3×1

7、06cfu、15.6×106cfu、7.8×106cfu、0cfu劑量的兩種細菌刺激巨噬細胞24小時后，收集細胞上清，ELISA檢測TNF-α和IL-6水平。
　　結果：
　?。?）在結腸癌小鼠模型實驗中，肝螺旋桿菌51448組和嗜酸乳桿菌pro15組小鼠生存率均高于對照組，實驗組和對照組相比在結腸長度并無差異，但是對照組小鼠腫瘤數(shù)量比實驗組小鼠多。HE染色和組化結果顯示實驗組小鼠結腸內炎癥細胞因子水平和對照組相比無顯著差異

8、。
　?。?）在小鼠急性肝損傷模型實驗中，肝螺旋桿菌51448組小鼠生存率高于對照組。
　?。?）具核梭桿菌25586、產(chǎn)腸毒素脆弱擬桿菌43860組與對照組相比，結腸長度，瘤子數(shù)量沒有明顯差異，但是通過進行ELISA實驗，發(fā)現(xiàn)25586組小鼠結腸組織培養(yǎng)上清中的IL-17、IFN-γ、IL-1β、TNF-α和IL-6等炎性細胞因子水平明顯高于對照組，提示25586介導了結腸的炎癥反應，對結腸癌的發(fā)展有顯著的促進作用。438

9、60細菌能夠促進部分炎癥細胞因子表達，有促進結腸癌發(fā)展的趨勢。根據(jù)流式細胞儀分析結果顯示，在CD4+T細胞中，我們可以看出25586組和43860組小鼠結腸內產(chǎn)生IFN-γ和IL-17的水平比對照組顯著增多，而T-reg陽性細胞的比例與對照組相比顯著減少。根據(jù)體外共培養(yǎng)的ELISA結果可知，與不加細菌刺激的對照組相比，25586細菌和43860細菌均能刺激巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α和IL-6，并且25586刺激巨噬細胞產(chǎn)生炎性因子的能力更強