腸缺血再灌注損傷時(shí)腸黏膜musashi-1、PCNA的表達(dá)及其意義.pdf

1、目的: 本研究是以小鼠小腸為研究對(duì)象，以腸缺血再灌注損傷（intestinal ischemia and reperfusion injury，IIRI）模型為基礎(chǔ)，通過(guò)觀察小腸黏膜的組織學(xué)改變，了解IIRI對(duì)小腸黏膜的損傷作用；通過(guò)檢測(cè)腸上皮干細(xì)胞的標(biāo)記物musashi-1（msi-1）以及增殖細(xì)胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在腸黏膜的表達(dá)變化，探討在IIRI時(shí)腸黏膜

2、損傷修復(fù)過(guò)程中腸上皮干細(xì)胞的作用機(jī)制。同時(shí)通過(guò)檢測(cè)msi-1 mRNA在腸IIRI不同時(shí)期的表達(dá)，從基因水平探討msi-1對(duì)小鼠小腸上皮干細(xì)胞的增殖發(fā)育可能發(fā)揮的生物學(xué)作用。 方法: 健康成年雄性昆明小鼠50只，體重18-22g。隨機(jī)分為5組，即：IIRI6h組、IIRI12h組、IIRI24h組、IIRI48h組和空白對(duì)照組，每組10只。采用腸系膜血管夾閉法制作腸IIRI模型，手術(shù)前12h，小鼠禁食，不限制飲水。經(jīng)腹腔

3、注射0．3%戊巴比妥1mL/kg（體重），麻醉成功后固定于手術(shù)臺(tái)，常規(guī)消毒鋪巾，經(jīng)腹正中線切開(kāi)腹壁，打開(kāi)腹腔，找到并分離腸系膜上動(dòng)脈，用無(wú)損傷動(dòng)脈夾夾閉其根部，濕紗布覆蓋腹壁。在腸系膜上動(dòng)脈夾閉期間，間斷地向腹腔內(nèi)注入生理鹽水約15～20mL/kg（體重），以預(yù)防松開(kāi)動(dòng)脈夾后出現(xiàn)的一過(guò)性低血容量反應(yīng)。20min后去掉動(dòng)脈夾，消毒皮膚，縫合腹壁。關(guān)腹后再向腹腔內(nèi)追加含慶大霉素32萬(wàn)U/L的生理鹽水約25～30mL/kg（體重），以達(dá)到擴(kuò)容

4、和預(yù)防腹腔手術(shù)時(shí)可能的污染。術(shù)后一籠一鼠，自由飲食。分別于IIRI術(shù)后6、12、24、48小時(shí)處死小鼠，距回盲部約10cm處取小腸組織約4cm，其中2cm標(biāo)本加入10%中性甲醛中固定，1、HE染色，光鏡下觀察腸黏膜病理改變，免疫組織化學(xué)，檢測(cè)分析PCNA和msi-1表達(dá)及其指數(shù)；另2cm標(biāo)本及時(shí)投入盛有RNAlater的EP管中，4℃過(guò)夜后-80℃冰箱中保存，待行RT-PCR檢測(cè)msi-1 mRNA在腸道黏膜上皮的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±

5、標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析，SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果: 1、大體觀察對(duì)照組腸管呈粉紅色，質(zhì)地柔軟，有光澤。IIRI組腸系膜上動(dòng)脈夾閉后，由該動(dòng)脈供血的腸管顏色變暗，呈紫色，失去光澤。 2、光鏡下見(jiàn)對(duì)照組小鼠腸道黏膜各層結(jié)構(gòu)正常，絨毛排列整齊；IIRI6h組改變不明顯，12h組絨毛萎縮變短、水腫，24h組絨毛嚴(yán)重受損，脫落明顯，排列紊亂，隱窩結(jié)構(gòu)密集，間質(zhì)明顯水腫，炎性細(xì)

6、胞浸潤(rùn)，48h組絨毛長(zhǎng)短不一，排列不整齊，隱窩結(jié)構(gòu)較前稀疏，間質(zhì)充血不明顯，其中以24h組腸道損傷表現(xiàn)最為明顯。 3、免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在正常的對(duì)照組小腸組織中，msi-1主要表達(dá)在小腸隱窩底部，潘氏細(xì)胞上面，與對(duì)照組相比，IIRI組msi-1表達(dá)增加，各組陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著增高（0．062±0．008；0．088±0．014；0．134±0．017；0．090±0．011 vs，0．021±0．003，P<0．01）； 24

7、h表達(dá)最強(qiáng)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，msi-1的表達(dá)減弱，至48h時(shí)與對(duì)照組相比（0．090±0．011）；在正常小腸組織中PCNA主要表達(dá)于腸隱窩中上部的細(xì)胞核內(nèi)，而在隱窩基底部表達(dá)較少，腸IIRI損傷后，PCNA表達(dá)開(kāi)始減弱，但I(xiàn)IRI6h時(shí)PCNA指數(shù)改變不明顯（0．79±0．072 vs．0．84±0．095，P>0．05），IIRI12h時(shí)PCNA開(kāi)始指數(shù)下降（0．69±0．090 vs．0．84±0．095，<0．01），IIRI24h

8、表達(dá)最弱（0．51±0．058 vs．0．84±0．095，P<0．01），IIRI48h又有增強(qiáng)（0．63±0．059 vs．0．84±0．095，P<0．01）。對(duì)IIRI損傷后，小鼠小腸黏膜破壞，絨毛隱窩結(jié)構(gòu)萎縮：免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與空白對(duì)照組相比，IIRI損傷組msi-1 mRNA表達(dá)增高，msi-1陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)顯著增高；至損傷后24h達(dá)到最高，48h又下降； RT-PCR也顯示msi-1 mRNA的類似表達(dá)情況。