類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血及滑液NKp44+NK細(xì)胞亞群功能研究.pdf

1、研究背景：
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見(jiàn)的以關(guān)節(jié)組織慢性炎癥為主要表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫性疾病。病變關(guān)節(jié)主要表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、血管翳形成以及由此導(dǎo)致的軟骨和骨的損傷。臨床表現(xiàn)為受累關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能下降,病變呈持續(xù)、反復(fù)過(guò)程。RA發(fā)病呈全球分布,在我國(guó)的發(fā)病率為0.26～0.5％,可發(fā)生于任何年齡,隨著年齡增加發(fā)病率也逐步增加。一般女性多發(fā),發(fā)病高峰在45～50歲之間

2、。RA病程纏綿、反復(fù),致殘率高,幾乎所有的RA患者都有不同程度的關(guān)節(jié)功能喪失,由此帶來(lái)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　 RA發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜,目前普遍認(rèn)為適應(yīng)性免疫反應(yīng)尤其是細(xì)胞免疫反應(yīng)在RA發(fā)病中起著重要作用:自身抗原被滑膜細(xì)胞吞噬、加工、處理后,將抗原信息傳遞給并激活T淋巴細(xì)胞,不僅可以使B細(xì)胞激活分化為漿細(xì)胞,分泌大量免疫球蛋白:而且活化的T淋巴細(xì)胞可以釋放出多種可溶性介質(zhì),如白介素-1(interlukin-1,IL-1)

3、、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等,促進(jìn)滑膜增生、誘導(dǎo)滑膜炎癥,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨大分子分解、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞及纖維結(jié)締組織增生。基于以上的機(jī)制研究,臨床上也出現(xiàn)了多種針對(duì)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的生物制劑,包括針對(duì)參與免疫反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞、信號(hào)分子及重要炎性細(xì)胞因子的治療,如TNF-α拮抗劑、IL-1受體拮抗劑等。其中TNF-α拮抗劑在臨床應(yīng)用最為廣泛,但是多個(gè)隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)表明約40-50％的RA患者使用一種TN

4、F-α拮抗劑6個(gè)月并不能達(dá)到ACR50改善,提示我們之前的理論并不能完全解釋RA的發(fā)病機(jī)制,而近來(lái)越來(lái)越多的研究證據(jù)顯示天然免疫反應(yīng)在RA發(fā)病中也具有重要作用,RA是天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)共同作用的結(jié)果。RA具體病因及發(fā)病機(jī)制,特別是天然免疫反應(yīng)在RA發(fā)病中的作用和機(jī)制尚未完全清楚。
　　 近年發(fā)現(xiàn)天然免疫細(xì)胞(NK、DC、γδT、NKT‘等)及其亞群亦參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié),其中隨著自然殺傷(Natural killer,NK)

5、細(xì)胞表型和功能的深入研究,NK細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中的作用愈來(lái)愈引起人們的重視。NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在抗病毒感染免疫、腫瘤免疫、移植排斥反應(yīng)以及免疫調(diào)節(jié)中起著十分重要的作用。NK細(xì)胞的免疫作用,與其細(xì)胞表面受體的表達(dá)密切相關(guān)。迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的NK細(xì)胞受體有幾十種,大致可分為三類:(1)自然細(xì)胞毒性受體(natural cytotoxicity receptor,NCR),包括NKp30、NKp44和NKp46。(2)C型

6、凝集素樣受體,如NKR-P1,NKG2D和CD94/NKG2A等。(3)免疫球蛋白超家族受體,如CD158a、CD158b等。這些受體按功能又可分為活化性受體和抑制性受體兩大類,通過(guò)與配體以特定的模式結(jié)合,整合活化性信號(hào)和抑制性信號(hào),從而調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活化和功能。研究發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞具有強(qiáng)大的細(xì)胞因子分泌功能,不僅調(diào)節(jié)天然免疫應(yīng)答,而且參與調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答,是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。NK細(xì)胞活化后能分泌多種細(xì)胞因子,引起自身和T、

7、B淋巴細(xì)胞的增殖活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生,從而激發(fā)更有效的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。越來(lái)越多的證據(jù)表明,NK細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞間接觸的形式發(fā)揮正向或負(fù)向的免疫學(xué)調(diào)節(jié)功能,在機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起重要作用,許多疾病(包括惡性腫瘤、自身免疫性疾病等)的發(fā)生可能與NK細(xì)胞調(diào)節(jié)功能異常或丟失有關(guān)。NK細(xì)胞在自身免疫性疾病發(fā)病中的作用及其機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。
　　 雖然NK細(xì)胞在RA發(fā)病中的確切作用及機(jī)制仍未完全清楚,但已有許多研究提示NK細(xì)胞在

8、RA發(fā)病過(guò)程中起著重要作用。早在二十世紀(jì)八十年代就發(fā)現(xiàn)RA患者外周血中NK細(xì)胞數(shù)量下降和殺傷功能受損。隨后的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn),NK細(xì)胞在RA發(fā)病中可能的作用機(jī)制包括:1、NK細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子參與RA發(fā)病。CD56bright NK細(xì)胞群在RA滑液中占主要優(yōu)勢(shì),其可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,如TNF-α、IFN-γ、IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)等,可與T細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞(dend

9、ric cell,DC)一起參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)的發(fā)生。NK細(xì)胞還可通過(guò)分泌IFN-r促進(jìn)B細(xì)胞的活化和樹(shù)突細(xì)胞的成熟來(lái)參與炎癥反應(yīng)。2、NK細(xì)胞同時(shí)也通過(guò)和其他細(xì)胞間的直接接觸來(lái)參與RA發(fā)病。NK細(xì)胞能夠提供T、B淋巴細(xì)胞的共刺激分子,如CD40L/OX40/CD70/CD86等分子；活化的NK細(xì)胞能夠通過(guò)NKp30,NKp46和DNAM-1識(shí)別并殺傷未成熟的樹(shù)突細(xì)胞；從RA患者關(guān)節(jié)滑液中分離出的NK細(xì)胞同單核細(xì)胞接觸培養(yǎng)后可以促進(jìn)單核

10、細(xì)胞分泌TNF-a等細(xì)胞因子；體外實(shí)驗(yàn)表明NK細(xì)胞與RA成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)的細(xì)胞間接觸能夠刺激成纖維樣滑膜細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子；最近有研究表明從RA患者關(guān)節(jié)滑液中分離的NK細(xì)胞能夠誘導(dǎo)CD14+的單核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞,該過(guò)程依賴NF-κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macro

11、phage colony-stimulating factor,MCSF),而后兩者均表達(dá)于滑液NK細(xì)胞,表明NK細(xì)胞在RA骨破壞中起著重要作用。
　　 長(zhǎng)期以來(lái)的研究表明,NK細(xì)胞并不是一個(gè)均一的細(xì)胞群體,根據(jù)表面標(biāo)志和功能的不同,可以將NK細(xì)胞分為不同的亞群。例如,根據(jù)NK細(xì)胞表面CD56分子表達(dá)密度的不同,可將NK細(xì)胞分為CD56bright和CD56dim亞群。這兩個(gè)細(xì)胞亞群在免疫應(yīng)答的過(guò)程中發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能:CD

12、56bright細(xì)胞活化后可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,具有免疫調(diào)節(jié)功能但殺傷功能較弱；而CD56dim細(xì)胞只產(chǎn)生少量的IFN-γ,主要發(fā)揮自然殺傷和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。在NK細(xì)胞多種受體中,NKp44受體屬于自然細(xì)胞毒性受體,其只表達(dá)于活化NK細(xì)胞表面,是NK細(xì)胞活化的主要標(biāo)志受體。因此,NKp44+NK細(xì)胞亞群在疾病發(fā)生中的作用受到了更多的關(guān)注。
　　 NKp44+NK細(xì)胞是人NK細(xì)胞的一個(gè)亞群,其表型特征為CD56+NK

13、p44+NK細(xì)胞。NKp44受體的配體的分子結(jié)構(gòu)尚未明確,既往研究發(fā)現(xiàn)NKp44受體能夠與流感病毒和副流感病毒表面的血凝素相結(jié)合。NKp44受體與其相應(yīng)配體結(jié)合后能夠有效地激活NK細(xì)胞,使其發(fā)揮細(xì)胞毒作用。既往關(guān)于RA患者NKp44+NK細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)RA患者滑液中NKp44+NK細(xì)胞比例較患者外周血及健康對(duì)照明顯升高,但NKp44+NK細(xì)胞在RA發(fā)病中的作用及其臨床意義并不清楚。最近美國(guó)華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Marina Cella等人在

14、炎性腸病患者的研究發(fā)現(xiàn),NKp44+NK細(xì)胞與傳統(tǒng)的NK細(xì)胞功能有較大差別,其殺傷功能減弱,但其能分泌多種細(xì)胞因子。NKp44+NK細(xì)胞可以促進(jìn)自身及其他免疫細(xì)胞聚集,促進(jìn)淋巴細(xì)胞粘附,在炎癥過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Marina Cella等人還在炎性腸病患者粘膜相關(guān)淋巴組織鑒定了一種新型的NK細(xì)胞-NK-22細(xì)胞,它是NKp44+NK細(xì)胞一個(gè)亞型,同時(shí)表達(dá)趨化因子受體CCR6。研究發(fā)現(xiàn),NK-22細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子,如IL-22、IL

15、-26、白血病抑制因子(leucocyte inhibitory factor,LIF)等,通過(guò)作用于結(jié)腸上皮成纖維細(xì)胞,促進(jìn)上皮細(xì)胞增生,起到限制炎癥和保護(hù)粘膜的作用。IL-22是NK-22細(xì)胞分泌的最主要細(xì)胞因子,NK-22細(xì)胞發(fā)揮功能主要是通過(guò)分泌IL-22實(shí)現(xiàn)的。IL-22是IL-10細(xì)胞因子家族的一員,是由特殊的免疫細(xì)胞群誘導(dǎo)產(chǎn)生,包括NK-22細(xì)胞、NKT細(xì)胞、T細(xì)胞等。IL-22可誘導(dǎo)體內(nèi)急性期反應(yīng)蛋白和趨化因子及基質(zhì)金屬

16、蛋白酶產(chǎn)生,可增強(qiáng)IL-1,TNF-a,IL-17等炎性細(xì)胞因子的致病作用。既往研究顯示IL-22在RA發(fā)病中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),RA患者成纖維樣滑膜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-22,可以誘導(dǎo)成纖維樣滑膜細(xì)胞增生及趨化因子的分泌,進(jìn)而促進(jìn)關(guān)節(jié)炎癥；C57BL/6小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collegen-induced arthritis,CIA)模型血清中檢測(cè)到持續(xù)高水平的IL-22；IL-22基因敲除小鼠對(duì)CIA易感性較野生型小鼠要低

17、,表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎發(fā)生率和血管翳減少,且低表達(dá)IL-1β,IL-6,TNF-a和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix matalloproteinase-9,MMP9)。研究還發(fā)現(xiàn)IL-22體外能促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖,提示IL-22與RA骨質(zhì)破壞有關(guān)。綜合上述研究結(jié)果,IL-22與RA炎癥及骨質(zhì)破壞密切相關(guān)。
　　 我們課題組的初步研究發(fā)現(xiàn),RA患者滑液及外周血確實(shí)存在NKp44+NK細(xì)胞亞群包括NK-22細(xì)胞,而健康對(duì)照外周血幾乎不存在NK

18、p44+NK細(xì)胞。NK-22細(xì)胞通過(guò)分泌IL-22在炎性腸病患者中發(fā)揮重要作用,而炎性腸病與RA同屬于自身免疫性疾病,RA患者體內(nèi)的NK-22細(xì)胞是否也可以通過(guò)分泌IL-22或者其他細(xì)胞因子進(jìn)而在RA發(fā)病中發(fā)揮重要作用,目前還沒(méi)有相關(guān)研究。本研究圍繞RA患者外周血和滑液NKp44+NK細(xì)胞亞群,從以下三個(gè)方面論證了NKp44+NK細(xì)胞亞群在RA發(fā)病中的作用及其對(duì)疾病活動(dòng)、病情和療效判斷的意義:1、通過(guò)檢測(cè)RA患者外周血及滑液NKp44+

19、NK細(xì)胞的表達(dá)及其細(xì)胞毒功能,并分析NKp44+NK細(xì)胞與疾病活動(dòng)的相關(guān)性,探討了NKp44+NK細(xì)胞檢測(cè)的臨床意義；2、通過(guò)研究NK-22細(xì)胞細(xì)胞毒功能、細(xì)胞因子分泌功能,及其分泌的細(xì)胞因子對(duì)RA成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖及趨化因子分泌的影響,探討了NK-22細(xì)胞在RA發(fā)病中的作用；通過(guò)研究NK-22細(xì)胞與疾病活動(dòng)的相關(guān)性,探討了NK-22細(xì)胞對(duì)判斷RA疾病活動(dòng)及病情的意義；3、通過(guò)研究青藤堿制劑聯(lián)合MTX治療RA有效后NK-22細(xì)胞數(shù)量變

20、化,分析治療后NK-22細(xì)胞與DAS28的相關(guān)性,進(jìn)一步探討NK-22細(xì)胞對(duì)疾病活動(dòng)和療效判斷的意義。綜上所述,深入了解RA患者NKp44+NK細(xì)胞亞群功能特征,從而明確其在RA發(fā)生發(fā)展中的作用,對(duì)揭示疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物靶標(biāo)、判斷病情和藥物療效具有重要意義。
　　 RA屬于祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“痹病”范疇,因人體遭受風(fēng)、寒、濕、熱之邪的侵襲,氣血為病邪陰閉而引起的疾病。以筋骨、肌肉、關(guān)節(jié)酸痛、麻木、重著、屈伸不利和關(guān)節(jié)腫大、灼熱等為臨

21、床主要表現(xiàn)。其主要病機(jī)是氣血痹阻不通,筋脈關(guān)節(jié)失于濡養(yǎng),以祛風(fēng)、除濕、舒筋活絡(luò)為治療大法。中醫(yī)藥治療RA歷史悠久,療效確切,且不良反應(yīng)相對(duì)較輕。青風(fēng)藤具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、鎮(zhèn)痛、利小便之功效,用于治療風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)腫痛、麻痹瘙癢等。早在1000多年前,青風(fēng)藤即開(kāi)始應(yīng)用于風(fēng)濕性疾病的治療。李時(shí)珍在《本草綱目》中稱清風(fēng)藤“主治風(fēng)疾,治風(fēng)濕流注、歷節(jié)鶴膝……”?！侗静輩R言》言:清風(fēng)藤,散風(fēng)寒濕痹之藥也,能舒筋活血,正骨利髓。其主要有效成分為青藤

22、堿,現(xiàn)代藥理研究顯示,青藤堿具有良好的抗炎和抗風(fēng)濕的作用。目前臨床上有多種以青風(fēng)藤為主要成分的中藥制劑治療RA取得了較好的療效。清風(fēng)痛膠囊也屬于青藤堿制劑,具有祛風(fēng)化濕、溫經(jīng)散寒、活血通絡(luò)的功效,既往藥理及臨床研究顯示對(duì)急、慢性炎癥具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛效果。
　　 甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)屬于緩解病情抗風(fēng)濕藥(disease-modifyingantirheumatic drugs,DMARDs)的一種,是二氫

23、葉酸還原酶抑制劑,通過(guò)阻止二氫葉酸還原為活化的四氫葉酸,使胸腺嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸的合成原料耗竭,抑制DNA和RNA的合成,從而抑制細(xì)胞的增生和復(fù)制。MTX屬于細(xì)胞周期特異性藥物,主要作用于S期。MTX可抑制體液免疫和細(xì)胞免疫,是目前治療RA的一線用藥。
　　 MTX及青藤堿制劑(清風(fēng)痛膠囊)治療RA療效肯定,且均可通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮作用,NK-22作為一種新發(fā)現(xiàn)的可能在RA發(fā)病中具有重要作用的細(xì)胞,MTX及青藤堿制劑(清風(fēng)痛膠

24、囊)是否可通過(guò)影響RA患者NK-22細(xì)胞途徑發(fā)揮治療作用,目前還沒(méi)有相關(guān)研究。
　　 本研究采用QGP技術(shù)(QuantiGene Plex)檢測(cè)NK-22細(xì)胞IL-22 mRNA、TNF-αmRNA含量,QGP結(jié)合了b-DNA(branched DNA)信號(hào)放大與Luminex xMAP液相芯片(liquid chip)平臺(tái),其優(yōu)勢(shì)是可直接從全血或細(xì)胞樣本中檢測(cè)mRNA表達(dá),無(wú)需進(jìn)行RNA提純、反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增,可以同時(shí)對(duì)極少

25、量樣本中的3～36個(gè)基因進(jìn)行高通量定量,是目前比較先進(jìn)的多基因定量檢測(cè)技術(shù)。
　　 研究目的：
　　 本研究為了證實(shí)NKp44+NK細(xì)胞亞群在RA發(fā)病中的作用及其對(duì)疾病活動(dòng)和病情判斷的意義,從三個(gè)方面研究了NKp44+NK細(xì)胞亞群的功能:
　　 1.研究RA患者外周血及滑液NKp44+NK細(xì)胞表達(dá)及其與疾病活動(dòng)的關(guān)系。
　　 2.研究NK-22細(xì)胞功能,探討NK-22細(xì)胞在RA發(fā)病中的作用及其對(duì)疾病活動(dòng)和

26、病情判斷的意義。
　　 3.研究青藤堿制劑聯(lián)合MTX對(duì)NK-22細(xì)胞影響,進(jìn)一步探討NK-22細(xì)胞在RA發(fā)病中的作用及其對(duì)病情和療效判斷的意義。
　　 方法：
　　 1研究對(duì)象
　　 2009年10月至2010年3月就診于南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院中醫(yī)風(fēng)濕科門診及住院治療的RA患者35例,男性7例,女性28例,平均年齡(46.8±10.3)歲?；顒?dòng)期RA患者20例,男性4例,女性16例,平均年齡(48.1±

27、10.8)歲,其中10例活動(dòng)期RA患者獲得滑液標(biāo)本。緩解期RA患者15例,男性3例,女性12例,平均年齡(46.6±8.7)歲。健康體檢人員20例,男性3例,女性17例,平均年齡(47±11.6)歲。
　　 2研究方法
　　 2.1 RA患者外周血及滑液NKp44+NK細(xì)胞表達(dá)及其臨床意義
　　 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)健康對(duì)照外周血、RA患者外周血及滑液NKp44+NK細(xì)胞比例,同時(shí)檢測(cè)NKp44+NK細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)穿孔素、

28、粒酶B、IFN-γ表達(dá)。分析RA患者外周血及滑液NKp44+NK細(xì)胞比例與DAS28評(píng)分、抗CCP抗體、RF的相關(guān)性。
　　 2.2 RA患者外周血及滑液NK-22細(xì)胞功能研究
　　 2.2.1 RA患者外周血、滑液及滑膜NK-22細(xì)胞檢測(cè)
　　 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)健康對(duì)照外周血、RA患者外周血及滑液NK-22細(xì)胞比例；免疫熒光鑒定RA滑膜NK-22細(xì)胞。
　　 2.2.2 NK-22細(xì)胞細(xì)胞毒功能檢測(cè)

29、>　　 流式細(xì)胞術(shù)分選NK-22細(xì)胞,體外懸浮培養(yǎng)兩周。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞純度,同時(shí)檢測(cè)NK-22細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)穿孔素、粒酶B、IFN-γ表達(dá)。
　　 2.2.3 NK-22細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-22、TNF-α濃度及IL-22 mRNA、TNF-α mRNA檢測(cè),NK-22細(xì)胞比例與外周血及滑液IL-22、TNF-α濃度的相關(guān)分析
　　 ELISA檢測(cè)NK-22細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-22、TNF-α濃度,QGP檢測(cè)NK-22細(xì)

30、胞IL-22 mRNA、TNF-α mRNA含量。ELISA檢測(cè)活動(dòng)期RA患者外周血及滑液IL-22、TNF-α濃度,分析NK-22細(xì)胞比例與IL-22、TNF-α的相關(guān)性。
　　 2.2.4 NK-22細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)RA FLS增殖的影響
　　 不同稀釋度NK-22細(xì)胞培養(yǎng)上清體外作用于RA成纖維樣滑膜細(xì)胞,MTT法檢測(cè)NK-22細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)RA成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖影響。NK-22上清中加入IL-22抗體和TNF-α

31、抗體,觀察兩種抗體對(duì)NK-22細(xì)胞上清促RA成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖作用的影響。
　　 2.2.5不同濃度rhIL-22對(duì)RA FLS分泌MCP-1的影響
　　 ELISA檢測(cè)不同濃度rhIL-22(1ng/ml,10ng/ml)對(duì)成纖維樣滑膜細(xì)胞分泌MCP-1的影響。
　　 2.2.6 NK-22細(xì)胞與RA疾病活動(dòng)的相關(guān)研究
　　 分析RA患者外周血及滑液NK-22細(xì)胞比例與DAS28評(píng)分、抗CCP抗體、R

32、F的相關(guān)性。
　　 2.3青藤堿制劑(清風(fēng)痛膠囊)聯(lián)合MTX對(duì)RA患者NK-22細(xì)胞的影響研究
　　 14例RA患者予口服清風(fēng)痛膠囊+MTX:清風(fēng)痛膠囊4粒/次,一日三次；MTX劑量7.5～15 mg,每周1次,口服,療程12周。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者治療后外周血NK-22細(xì)胞比例；分析治療后NK-22細(xì)胞與DAS28的相關(guān)性。
　　 3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)

33、差((x)±s)或中位數(shù)±四分位數(shù)間距(M±INQ)表示。正態(tài)分布計(jì)量資料兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量方差分析,兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料采用多重非參數(shù)檢驗(yàn)或兩樣本非參數(shù)檢驗(yàn),相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析方法,雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1 RA患者外周血及滑液NKp44+NK細(xì)胞表達(dá)及其臨床意義
　　

34、活動(dòng)期、緩解期RA患者及健康對(duì)照外周血NKp44+NK細(xì)胞比例分別為1.480％、0.540％、0.000％,活動(dòng)期RA患者外周血NKp44+細(xì)胞比例高于緩解期和健康對(duì)照(x2=46.708,P=0.000)。10例活動(dòng)期RA患者滑液NKp44+細(xì)胞比例為15.645％,高于自身外周血NKp44+細(xì)胞比例2.540％(z=-3.780,P=0.000)。NKp44+NK細(xì)胞表達(dá)低水平的穿孔素(0.08％)、粒酶B(0.34％)、IFN-

35、γ(0.12％)。活動(dòng)期RA患者DAS28評(píng)分、抗CCP抗體濃度、RF滴度分別為4.63、287.8U/ml、300.08IU/ml；10例有關(guān)節(jié)積液RA患者DAS28評(píng)分、抗CCP抗體濃度、RF滴度分別為4.95、359.4U/ml、238.68IU/ml?；顒?dòng)期RA患者外周血NKp44+NK細(xì)胞比例與DAS28評(píng)分、抗CCP抗體呈正相關(guān)(r=0.777,P=0.000；r=0.967,P=0.000),與RF無(wú)相關(guān)性(r=-0.34

36、3,P=0.138)。滑液NKp44+NK細(xì)胞比例與DAS28評(píng)分、抗CCP抗體呈正相關(guān)(r=0.930,P=0.000；r=0.867,P=0.001),與RF無(wú)相關(guān)性(r=0.564,P=0.090)。
　　 2 RA患者外周血及滑液NK-22細(xì)胞功能研究
　　 2.1 RA患者外周血、滑液及滑膜NK-22細(xì)胞檢測(cè)
　　 RA患者外周血NK-22細(xì)胞比例為0.690％,高于健康對(duì)照外周血NK-22細(xì)胞比例0.

37、000％(z=-6.225,P=0.000)。10例活動(dòng)期RA患者滑液NK-22細(xì)胞比例為4.165％,高于自身外周血NK-22細(xì)胞比例1.195％(z=-3.781,P=0.000)。免疫熒光發(fā)現(xiàn)RA滑膜組織存在NK-22細(xì)胞,NK-22細(xì)胞為NKp44+CCR6+雙陽(yáng)性細(xì)胞,紅色和綠色疊加后熒光為黃色。
　　 2.2 NK-22細(xì)胞細(xì)胞毒功能檢測(cè)
　　 流式細(xì)胞術(shù)分選2x104個(gè)NK-22細(xì)胞,共分選3次。細(xì)胞純度>

38、90％。NK-22細(xì)胞低表達(dá)穿孔素(0.07％)、粒酶B(0.26％)、IFN-γ(0.11％)。
　　 2.3 NK-22細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-22、TNF-α濃度及IL-22 mRNA、TNF-a mRNA檢測(cè),NK-22細(xì)胞比例與外周血及滑液IL-22、TNF-α濃度的相關(guān)分析
　　 PMA和ionomycin刺激后NK-22細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-22、TNF-α濃度分別為(1293.971±345.048)pg/ml和

39、(272.238±83.471)pg/ml。NK-22細(xì)胞IL-22 mRNA、TNF-α mRNA水平高于正常NK細(xì)胞(P<0.01)?；顒?dòng)期RA患者外周血TNF-α和IL-22濃度分別為(313.059±90.513)pg/ml、(5.34±1.614)ng/ml；滑液TNF-α和IL-22濃度分別為(681.245±65.996)pg/ml、(7.22±1.249)ng/ml。RA患者外周血NK-22細(xì)胞與外周血IL-22和TNF

40、-α濃度成正相關(guān)(r=0.869,P=0.000；r=0.957,P=0.000),滑液NK-22細(xì)胞與滑液IL-22和TNF-α濃度成正相關(guān)(r=0.930,P=0.000;r=0.967,P=0.000)。
　　 2.4 NK-22細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)RA FLS增殖的影響
　　 NK-22細(xì)胞上清(IL-22、TNF-α濃度分別為941.82 pg/ml和368.1 pg/ml)作用24小時(shí)即能刺激RA FLS增殖,且在

41、一定范圍內(nèi)呈時(shí)間劑量依賴性。作用48小時(shí),NK-22細(xì)胞上清1:2稀釋組也能刺激RA FLS增殖。作用72小時(shí)和96小時(shí),NK-22細(xì)胞上清1:4稀釋組均能刺激RA FLS增殖。50ug/ml IL-22抗體和1.2ug/ml TNF-α抗體能夠完全抑制NK-22細(xì)胞上清促RA FLS增殖作用。
　　 2.5不同濃度rhIL-22對(duì)RA FLS分泌MCP-1的影響
　　 1ng/ml rhIL-22和10ng/ml rh

42、IL-22作用72小時(shí)均能促進(jìn)RA FLS分泌MCP-1,10ng/ml rhIL-22組RA FLS上清MCP-1濃度高于1ng/ml rhIL-22組(P<0.05)。
　　 2.6 NK-22細(xì)胞與RA疾病活動(dòng)的相關(guān)研究
　　 活動(dòng)期、緩解期RA患者及健康對(duì)照外周血NK-22細(xì)胞比例分別為0.805％、0.510％、0.000％,活動(dòng)期RA患者外周血NK-22細(xì)胞比例高于緩解期和健康對(duì)照(x2=40.193,P=0

43、.000)。RA患者外周血NK-22細(xì)胞比例與DAS28評(píng)分、抗CCP抗體成正相關(guān)(r=0.9757,P=0.000；r=0.717,P=0.000),與RF沒(méi)有相關(guān)性(r=0.067,P=0.799)?；篘K-22細(xì)胞比例與DAS28評(píng)分、抗CCP抗體、RF均成正相關(guān)(r=0.918,P=0.000;r=0.851,P=0.002；r=0.784,P=0.007)。
　　 3青藤堿制劑(清風(fēng)痛膠囊)聯(lián)合MTX對(duì)RA患者NK-

44、22細(xì)胞的影響研究
　　 14例活動(dòng)期RA患者治療后NK-22細(xì)胞比例較治療前下降(P<0.05)。RA患者治療后NK-22細(xì)胞比例與治療后DAS28評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.836,P=0.000)
　　 結(jié)論：
　　 1.RA患者外周血及滑液NKp44+NK細(xì)胞數(shù)量明顯升高,細(xì)胞毒功能減弱。
　　 2.NKp44+NK細(xì)胞與RA疾病活動(dòng)度和嚴(yán)重程度密切相關(guān)。
　　 3.RA患者外周血及滑液NK-2

45、2細(xì)胞數(shù)量明顯升高,細(xì)胞毒功能減弱；RA滑膜也存在NK-22細(xì)胞。
　　 4.IL-22和TNF-α是NK-22細(xì)胞體外分泌的最主要細(xì)胞因子,NK-22通過(guò)分泌IL-22和TNF-a從以下幾個(gè)方面參與RA發(fā)病:(1)NK-22細(xì)胞上清能刺激RA FLS增殖,在一定范圍內(nèi)呈時(shí)間、劑量依賴性。(2)rhIL-22能刺激RA MCP-1的分泌。
　　 5.NK-22細(xì)胞與RA疾病活動(dòng)度和嚴(yán)重程度密切相關(guān)。
　　 6.青