關(guān)于抗生素殘留飛行時(shí)間質(zhì)譜分析方法學(xué)與青霉素降解規(guī)律的研究.pdf

1、飛行時(shí)間質(zhì)譜具有采集速度快、靈敏度高、質(zhì)量準(zhǔn)確度高、分辨率高和m/z范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已用于藥物的快速篩查以及藥物的降解代謝方面的研究?？股卦谛竽翗I(yè)中起著舉足輕重的作用，抗生素的濫用導(dǎo)致的各種藥物殘留給人類健康帶來(lái)了很大的危害。近年來(lái)，對(duì)抗生素的篩查檢測(cè)逐漸成為熱點(diǎn)，幾年前的“三聚氰胺”事件已引起人們對(duì)食品安全的高度重視。青霉素等抗生素在奶牛養(yǎng)殖業(yè)的濫用，其殘留對(duì)食品安全具有潛在的危險(xiǎn)性。因此，飼料和食品中抗生素殘留檢測(cè)和“無(wú)抗奶”的鑒

2、定對(duì)于人類健康極為重要。“解抗劑”β-內(nèi)酰胺酶的違規(guī)使用給乳制品中青霉素殘留檢測(cè)鑒定帶來(lái)困擾。本課題主要為飼料和食品中抗生素快速篩查與準(zhǔn)確定量建立了液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜高通量、多種類、多殘留、高靈敏分析新方法;考察了水溶液中青霉素降解和酶解規(guī)律及克拉維酸和舒巴坦的抑酶作用;首次探明了牛奶中青霉素降解和酶解規(guī)律,提出了牛奶中青霉素代謝途徑;利用制備色譜、質(zhì)譜、紅外光譜和核磁共振譜分別制備和表征了可作為標(biāo)準(zhǔn)物和標(biāo)示物的青霉素降解產(chǎn)物－脫羧

3、青霉素噻唑酸。本論文成果為食品安全檢測(cè)和評(píng)價(jià)提供了方法學(xué)基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。本文的主要內(nèi)容如下：
　　1、介紹了飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的原理，并對(duì)飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在食品安全、抗生素降解、環(huán)境監(jiān)測(cè)、生物大分子分析等領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。
　　2、優(yōu)化了全自動(dòng)快速溶劑萃取雞飼料、豬飼料和魚飼料中23種抗生素獸藥的條件。在優(yōu)化的超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS)條件下，自建了包括這些抗生素獸

4、藥母離子的保留時(shí)間、精確質(zhì)量、元素組成和同位素等信息的數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)各種飼料進(jìn)行 QTOF-MSE掃描及數(shù)據(jù)采集,依據(jù)自建的數(shù)據(jù)庫(kù)，采用 MassLynx ChromLynx軟件進(jìn)行快速篩查辨別，并采用標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)或二級(jí)質(zhì)譜圖比對(duì)發(fā)現(xiàn)的陽(yáng)性目標(biāo)化合物進(jìn)一步加以確認(rèn)。所建立的快速溶劑萃取-UPLC-QTOF-MS方法用于飼料中23種限用或禁用的抗生素獸藥檢測(cè)具有良好的線性范圍、檢出限、精密度和準(zhǔn)確度。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所購(gòu)商品獸藥均為三種以上限用抗

5、生素的混合物，商品獸藥中有效抗生素成分與標(biāo)注的有效抗生素成分差異較大。有些飼料中還發(fā)現(xiàn)含有禁用的呋喃唑酮、利巴韋林和地美硝唑。該方法可用于飼料中抗生素殘留的快速篩查、確認(rèn)和定量。
　　3、采用超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-QTOF/MS）技術(shù),建立了一種簡(jiǎn)單快速的同時(shí)測(cè)定蜂蜜中獸藥多種類、多殘留分析方法。研究對(duì)象包括林可霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類、硝基咪唑類、氨基糖苷類和激素類等

6、14類90種獸藥。樣品用改進(jìn)的QuEChERS法處理效果良好，無(wú)需進(jìn)一步凈化。通過(guò)ACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱進(jìn)行分離，以0.1％(V/V)甲酸水和乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。利用Analyst? TF1.6軟件建立了90種獸藥高分辨二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)和相應(yīng)的4張不同碰撞能量的二級(jí)質(zhì)譜圖，對(duì)藥物殘留進(jìn)行篩查和確證?？疾煸u(píng)價(jià)了方法的線性、靈敏度、準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性和再現(xiàn)性。90種獸藥在至少2個(gè)數(shù)量級(jí)濃度范圍內(nèi)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線線

7、性良好（R2>0.9933）。檢出限為0.10～5.41μ g/kg,定量限為0.32～18.03μ g/kg。日內(nèi)精密度(RSD, n=6)不超過(guò)10.9%，日間精密度(RSD, n=6)不超過(guò)13.5%。3個(gè)添加水平平均回收率為70.63%～114.62%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為1.87%～9.57%。該方法操作簡(jiǎn)單、快速、高效,高通量，適用于蜂蜜中多種類、多殘留獸藥的篩查和定量檢測(cè)。
　　4、利用高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜

8、（HPLC-TOF/MS）研究了在水溶液中青霉素G、青霉素V、氨芐西林和阿莫西林的降解反應(yīng)。探討了溫度與時(shí)間、酸度對(duì)降解反應(yīng)的影響。結(jié)果表明：這四種青霉素在水溶液中的降解情況相類似，在pH在4到7之間，相對(duì)比較穩(wěn)定，而當(dāng)溶液的pH超過(guò)8的時(shí)候，青霉素的降解速度加快，此時(shí)，青霉素僅降解為相應(yīng)的青霉噻唑酸。完全降解10μg青霉素G、青霉素V、氨芐西林和阿莫西林所需β-內(nèi)酰胺酶的量分別為10U、10U、11U和7U。在20℃~30℃條件下，青

9、霉素G、青霉素V、阿莫西林和氨芐西林完全降解所需的時(shí)間分別為2、2.5、2.5和1.5 h。當(dāng)溫度低于40℃時(shí)，產(chǎn)物主要以青霉噻唑酸的形式存在，超過(guò)60℃時(shí)，酶解產(chǎn)物主要以脫羧青霉噻唑酸的形式存在。水溶液中青霉素和β-內(nèi)酰胺酶的降解反應(yīng)最適宜的pH為6～8，但是在不同的pH下，青霉噻唑酸和脫羧青霉噻唑酸的比例也不相同。研究結(jié)果對(duì)青霉素的臨床用藥和β-內(nèi)酰胺酶的合理使用具有一定的指導(dǎo)意義，也為在β-內(nèi)酰胺酶存在下乳制品中青霉素的降解研究提

10、供了思路和方法基礎(chǔ)。同時(shí)，研究了在水溶液中克拉維酸和舒巴坦對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的抑制作用。結(jié)果表明，克拉維酸的抑酶作用均強(qiáng)于舒巴坦，且阿莫西林和克拉維酸聯(lián)合時(shí)，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的抑制作用非常明顯高于青霉素G、青霉素V和氨芐西林。通過(guò)考察克拉維酸和舒巴坦分別與β-內(nèi)酰胺酶作用25min后的抑酶率，發(fā)現(xiàn)在水溶液中當(dāng)克拉維酸和抗生素的比例達(dá)到1:1時(shí)，抑酶率達(dá)到100%;當(dāng)舒巴坦和抗生素的比例達(dá)到8:1時(shí)，抑酶率達(dá)到100%。
　　5、利用高效

11、液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（HPLC-TOF/MS）研究了在牛奶中青霉素G、青霉素V、氨芐西林和阿莫西林的降解反應(yīng),提出了在β-內(nèi)酰胺酶存在下牛奶中青霉素的降解途徑。通過(guò)比較試驗(yàn)考察了β-內(nèi)酰胺酶的用量、溫度、時(shí)間和酸度等因素對(duì)降解的影響。在β-內(nèi)酰胺酶存在下牛奶中青霉素的降解規(guī)律與水溶液(pH6?7)中的降解規(guī)律相類似。在不同的溫度和pH條件下，青霉素的的兩種降解產(chǎn)物（青霉素G噻唑酸/脫羧青霉素G噻唑酸，青霉素V噻唑酸/脫羧青霉素V噻唑酸

12、，氨芐西林噻唑酸/脫羧氨芐西林噻唑酸,阿莫西林噻唑酸/脫羧阿莫西林噻唑酸)的比例是不同的。當(dāng) pH=6和低于40℃時(shí)，青霉噻唑酸是主要的降解產(chǎn)物，但其不穩(wěn)定，不能用作標(biāo)準(zhǔn)物來(lái)準(zhǔn)確定量青霉素噻唑酸，也不能作為標(biāo)示物來(lái)判定青霉素在牛奶中是否存在。在pH=2和高于40℃條件下，青霉素噻唑酸逐漸向脫羧青霉噻唑酸轉(zhuǎn)化，脫羧青霉噻唑酸是穩(wěn)定的降解產(chǎn)物，能夠用作標(biāo)準(zhǔn)物用于定量分析，也可作為標(biāo)示物來(lái)推判青霉素在牛奶中是否存在。
　　6.通過(guò)對(duì)β-

13、內(nèi)酰胺酶存在下青霉素降解規(guī)律的分析，建立了反相高效液相純化色譜制備脫羧青霉G噻唑酸、脫羧青霉V噻唑酸、脫羧氨芐西林噻唑酸和脫羧阿莫西林噻唑酸的方法，同時(shí)以紅外、核磁、色譜、質(zhì)譜技術(shù)對(duì)對(duì)所制得產(chǎn)物脫羧青霉噻唑酸的進(jìn)行了表征和確證。脫羧青霉G噻唑酸、脫羧青霉V噻唑酸、脫羧氨芐西林噻唑酸和脫羧阿莫西林噻唑酸的純度分別達(dá)到94%、92%、89%和91%。結(jié)果表明，此法制備脫羧青霉噻唑酸方便、可行，得到的產(chǎn)物可用用作標(biāo)準(zhǔn)物用于定量分析，也可作為標(biāo)