Th細(xì)胞發(fā)育可塑性的表觀遺傳機(jī)制與疾病表型研究.pdf

1、本文對(duì)Th細(xì)胞發(fā)育可塑性的表觀遺傳機(jī)制與疾病表型進(jìn)行了研究。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：正常小鼠Th優(yōu)勢(shì)漂移的發(fā)育編程及其DNA甲基化修飾機(jī)制。
　　目的：尋找小鼠Th優(yōu)勢(shì)漂移的關(guān)鍵基因；觀察關(guān)鍵基因表達(dá)的漂移軌跡；研究關(guān)鍵基因表達(dá)活性漂移的表觀遺傳機(jī)制。
　　方法：CBA法檢測(cè)不同周齡正常BalBc小鼠血漿中IL-4、IFN-γ水平，熒光定量PCR檢測(cè)CD4+脾細(xì)胞及心肌細(xì)胞中Th相關(guān)細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，

2、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD4+脾細(xì)胞內(nèi)IL-4、IFN-γ強(qiáng)度，獲得Th優(yōu)勢(shì)漂移的正常軌跡；CBA檢測(cè)腹腔注射5-AZA后血漿IL-4、IFN-γ水平變化；甲基化測(cè)序分析不同周齡正常BalBc小鼠CD4+脾細(xì)胞及心肌細(xì)胞中IL-4、IFN-γ啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化水平；對(duì)于胎鼠CD4+脾細(xì)胞進(jìn)行DHS分析，甲基化特異性PCR檢測(cè)不同周齡正常小鼠CD4+脾細(xì)胞DHS位點(diǎn)DNA甲基化，獲得Th2調(diào)控區(qū)域DNA甲基化漂移軌跡；WESTERN BlO

3、T分析不同周齡小鼠CD4+脾細(xì)胞DNMTs水平。
　　結(jié)果：⑴血漿IL-4濃度隨周齡呈下降趨勢(shì)，1、2、3周齡小鼠血漿IL-4濃度明顯高于較大周齡小鼠，自4周起IL-4濃度無(wú)明顯差異；血漿IFN-γ隨周齡呈增加趨勢(shì)，1、2、3、4周小鼠血漿IFN-γ濃度明顯低于較大周齡小鼠，自5周起IFN-γ濃度無(wú)明顯差異。⑵隨周齡增長(zhǎng)CD4+脾細(xì)胞IL-4mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì)，其中1、2周齡小鼠IL-4mRNA表達(dá)明顯高于其余各周齡小鼠；隨周

4、齡增長(zhǎng)IFN-γ RNA表達(dá)呈增加趨勢(shì)，其中1、2、3周齡小鼠IFN-γ mRNA表達(dá)明顯低于其余各周齡小鼠；各周齡小鼠CD4+脾細(xì)胞內(nèi)IL-5、IL-13、T-bet、STAT1、STAT4、GATA3、STAT6mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異。⑶各周齡小鼠CD4+脾細(xì)胞內(nèi)DNMT1、DNMT3bmRNA表達(dá)無(wú)明顯變化趨勢(shì)；隨周齡增長(zhǎng)CD4+脾細(xì)胞內(nèi)DNMT3amRNA表達(dá)明顯增加，至7周齡后無(wú)明顯差異。⑷小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)IL-4、IFN-γ

5、mRNA幾乎不表達(dá)；各周齡小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)DNMT1、DNMT3a、DNMT3bmRNA無(wú)明確變化趨勢(shì)。⑸CD4+脾細(xì)胞內(nèi)IL-4陽(yáng)性細(xì)胞隨周齡增長(zhǎng)逐漸下降，至7周齡起無(wú)明顯差異；IFN-γ陽(yáng)性細(xì)胞隨周齡增長(zhǎng)逐漸增加，至7周齡起無(wú)明顯差異；⑹1周及3周齡小鼠CD4+脾細(xì)胞IL-4啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化程度明顯低于大周齡小鼠；IFN-γ啟動(dòng)子區(qū)隨周齡增長(zhǎng)甲基化程度逐漸降低；不同周齡小鼠心肌細(xì)胞IL-4、IFN-γ啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化無(wú)明顯隨周

6、齡變化的趨勢(shì)；⑺胚胎小鼠CD4+脾細(xì)胞Th2相關(guān)區(qū)域共有10個(gè)DHS，分別為:RSH6、RSH7、IL-13P、CNS-1、HSⅠ、HSⅡ、HSⅢ、HSⅣ、HSⅤ、HSⅤA。⑻除1周齡時(shí)處于一定程度的去甲基化外，RSH6、HSVa區(qū)域在其余各周齡小鼠CD4+脾細(xì)胞均處于高度甲基化；IL-13P在各周齡小鼠CD4+脾細(xì)胞均處于一定程度去甲基化，無(wú)明顯周齡變化趨勢(shì)；HSⅡ在各周齡小鼠CD4+脾細(xì)胞均處于完全去甲基化，無(wú)明顯周齡變化趨勢(shì)；Ⅲ、

7、HSⅣ區(qū)域在各周齡小鼠CD4+脾細(xì)胞均處于完全甲基化，無(wú)明顯周齡變化趨勢(shì)；RSH7、CNS-1、HSⅠ、HSⅤ區(qū)域隨周齡增加去甲基化逐漸明顯；各周齡小鼠心肌細(xì)胞RSH6、RSH7、CNS-1、HSⅢ、HSⅣHSⅤ、HSVa區(qū)域均呈高度甲基化狀態(tài)；IL-13P及HSⅠ區(qū)域呈一定程度的去甲基化，無(wú)明顯周齡變化趨勢(shì)；HSⅡ區(qū)域呈去甲基化狀態(tài)，無(wú)明顯周齡變化趨勢(shì)。⑻腹腔注射5-AZA后，1及2周齡小鼠均死亡，存活小鼠血漿IL-4、IFN-γ呈現(xiàn)

8、出雜亂無(wú)章改變。
　　結(jié)論：IL-4及IFN-γ是Th漂移的關(guān)鍵基因。Th2組件DNA甲基化的漂移可能是Th表型漂移的物質(zhì)基礎(chǔ)，而CD4+細(xì)胞內(nèi)DNMTs尤其DNMT3a的水平隨發(fā)育變化可能是Th表型漂移的分子基礎(chǔ)。
　　第二部分：哮喘相關(guān)因素對(duì)Th2調(diào)控組件DNA甲基化及Th優(yōu)勢(shì)表型的影響。
　　目的：觀察RSV感染對(duì)于Th表型及Th2調(diào)控組件DNA甲基化漂移軌跡的影響，研究RSV感染后滯效應(yīng)的表觀遺傳機(jī)制。

9、　　方法：對(duì)不同周齡BalBc小鼠進(jìn)行RSV感染，分別于感染后1周、3周及12周齡時(shí)處死，分析CD4+脾細(xì)胞內(nèi)IL-4及IFN-γmRNA表達(dá)、Th調(diào)控組件DNA甲基化水平，觀察RSV感染對(duì)于Th優(yōu)勢(shì)及DNA甲基化漂移軌跡的影響；對(duì)不同周齡BalBc小鼠進(jìn)行RSV感染，分別于12周、13周時(shí)腹腔注射OVA，14周起連續(xù)霧化OVA1周，第15周時(shí)處死小鼠，分析不同周齡RSV感染對(duì)于OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠CD4+脾細(xì)胞內(nèi)IL-4及IFN-γmR

10、NA表達(dá)、肺部病理的影響；對(duì)不同周齡BalBc小鼠進(jìn)行RSV感染，分別于15周、16周時(shí)腹腔注射OVA，17周起連續(xù)霧化OVA1周，第18周時(shí)處死小鼠，分析不同周齡RSV感染對(duì)于OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠CD4+脾細(xì)胞內(nèi)IL-4及IFN-γmRNA表達(dá)、肺部病理的影響；連續(xù)于3周、5周、7周時(shí)反復(fù)進(jìn)行RSV感染，分別于15周、16周時(shí)腹腔注射OVA，17周起連續(xù)霧化OVA1周，第18周時(shí)處死小鼠，分析反復(fù)RSV感染對(duì)于OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠CD4+

11、脾細(xì)胞內(nèi)IL-4及IFN-γ mRNA表達(dá)、肺部病理、Th調(diào)控組件DNA甲基化水平的影響；免疫熒光檢測(cè)不同周齡小鼠RSV感染后1周CD4+脾細(xì)胞DNMT3a、DNMT1、DNMT3b表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴與無(wú)感染同齡小鼠相比，不同周齡小鼠在RSV感染1周后血漿IL-4、IFN-γ均增加，肺部炎癥反應(yīng)均明顯，CD4+脾細(xì)胞內(nèi)DHS位點(diǎn)均呈去甲基化；⑵3、5、8、9周齡小鼠分別RSV感染3周后，血漿IL-4及IFN-γ濃度、肺部炎癥反應(yīng)

12、與同周齡正常小鼠無(wú)差別；3周及5周齡初次感染小鼠3周后PMA刺激下IL-4陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯高于同齡正常小鼠，CD4+脾細(xì)胞RSH7、HSⅠ、CNS-1、HSⅤ4個(gè)位點(diǎn)的DNA甲基化較同周齡小鼠低下,而8周、9周齡初次感染小鼠與同齡正常小鼠無(wú)差異；⑶與無(wú)初次RSV感染的小鼠相比，3周齡、5周齡初次感染小鼠在12周時(shí)CD4+脾細(xì)胞內(nèi)RSH7、HSⅠ、CNS-1、HSⅤ4個(gè)位點(diǎn)的DNA甲基化低下，OVA誘導(dǎo)后CD4+脾細(xì)胞IL-4mRNA表達(dá)

13、增高，肺部炎癥表現(xiàn)明顯；7周、8周、9周齡初次感染小鼠12周時(shí)CD4+脾細(xì)胞內(nèi)RSH7、HSⅠ、CNS-1、HSⅤ4個(gè)位點(diǎn)的DNA甲基化與正常小鼠無(wú)差異，OVA誘導(dǎo)后肺部炎癥反應(yīng)及IL-4表達(dá)無(wú)明顯差異。⑷與無(wú)初次RSV感染的小鼠相比，3周齡、5周齡、7周齡、8周齡、9周齡時(shí)初次感染小鼠在15周CD4+脾細(xì)胞內(nèi)DHS位點(diǎn)DNA甲基化無(wú)明顯差異，OVA誘導(dǎo)后CD4+脾細(xì)胞IL-4mRNA表達(dá)、肺部炎癥亦無(wú)差異。⑸與正常小鼠相比，于3周、5

14、周、7周齡時(shí)連續(xù)進(jìn)行RSV感染小鼠，15周齡時(shí)CD4+脾細(xì)胞內(nèi)RSH7、HSⅠ、CNS-1、HSⅤ4個(gè)位點(diǎn)的DNA甲基化低下，OVA誘導(dǎo)后 CD4+脾細(xì)胞IL-4mRNA表達(dá)增高，肺部炎癥表現(xiàn)明顯。⑹小鼠初次RSV感染后1周CD4+脾細(xì)胞DNMT3a、DNMT3b免疫熒光強(qiáng)度較同周齡小鼠無(wú)明顯差異,DNMT1免疫熒光強(qiáng)度明顯減弱。
　　結(jié)論：RSV感染可以通過(guò)影響CD4+脾細(xì)胞DNMT1的表達(dá)，使得Th2相關(guān)組件DNA甲基化漂移延

15、遲，而后續(xù)接觸其余不良因素則更易誘導(dǎo)出Th2優(yōu)勢(shì)的偏斜。
　　第三部分：哮喘相關(guān)因素對(duì)Th2調(diào)控組件DNA甲基化及Th優(yōu)勢(shì)表型影響的分子機(jī)制探討。
　　目的：探討RSV感染及OVA暴露對(duì)Th2調(diào)控組件DNA甲基化產(chǎn)生影響的分子機(jī)制。
　　方法：比較RSV、紫外線(xiàn)滅活RSV接觸小鼠肺部炎癥、CD4+脾細(xì)胞內(nèi)IL-4及IFN-γ mRNA水平、Th2調(diào)控組件DHS位點(diǎn)DNA甲基化的差異；觀察OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠肺部及CD4+

16、脾細(xì)胞DNMTs、DNA甲基化的情況；研究腹腔注射5-AZA對(duì)于OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠肺部炎癥及CD4+脾細(xì)胞內(nèi)IFN-γ、IL-4mRNA水平影響；檢測(cè)RSV及OVA誘導(dǎo)后肺部TSLP、IL-33、IL-25mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴滅活RSV滴鼻（RSV-組）氣道炎癥較RSV感染小鼠（RSV+組）明顯減輕； RSV+組小鼠3周后PMA刺激下IL-4陽(yáng)性細(xì)胞比例較正常小鼠明顯增高，RSV-組無(wú)明顯差異。⑵RSV-組、RSV+組小鼠

17、CD4+脾細(xì)胞RSH6、IL-13P、HSⅡ、HSⅢ、HSⅣ、HSⅤA等6個(gè)位點(diǎn)的DNA甲基化水平均無(wú)差異；RSV感染小鼠在3周后RSH7、HSⅠ、CNS-1、HSⅤ4個(gè)位點(diǎn)的DNA甲基化明顯低于同周齡小鼠，滅活RSV接觸小鼠與同周齡小鼠相比無(wú)明顯差異。⑶與正常同齡小鼠相比，OVA誘導(dǎo)小鼠CD4+脾細(xì)胞及肺部DNMT3a、DNMY3b的表達(dá)增高，除HSⅡ外，其余9個(gè)Th2相關(guān)DHS均為完全的去甲基化，IFN-γ啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度增高。

18、⑷RSV感染、OVA誘導(dǎo)小鼠肺部TSLP、IL-33、IL-25mRNA表達(dá)均較正常小鼠明顯增加。⑸與僅OVA誘導(dǎo)的小鼠相比，腹腔注射5-AZA的OVA誘導(dǎo)小鼠CD4+脾細(xì)胞內(nèi)IL-4mRNA降低，IFN-γ稍增高；5AZA+OVA組小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞比例顯著低于OVA組，腹腔注射5-AZA后OVA誘導(dǎo)的氣道炎癥明顯減輕。
　　結(jié)論：RSV對(duì)于DNA甲基化的影響與其病毒復(fù)制、致病性有關(guān)；氣道