A151抑制缺氧BMDM的炎癥及其在腦缺血性損害中的治療潛能.pdf

1、腦卒中是目前對人類危害最嚴(yán)重的疾病之一。腦卒中是高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率、高死亡率、高經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的“五高”疾病。在我國，腦卒中是位列第一的死亡原因。免疫炎癥在卒中的發(fā)生發(fā)展的病理發(fā)展過程中起重要作用。炎癥是機(jī)體對刺激做出的一種防御反應(yīng)，在生物體內(nèi)起重要作用。當(dāng)受到刺激因子的刺激時(shí)，會誘發(fā)炎癥反應(yīng)，從而修復(fù)組織，抵抗損傷。炎癥也會對機(jī)體產(chǎn)生不良影響，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂。已經(jīng)知道炎癥和免疫與卒中尤其是缺血性腦卒中的多種危險(xiǎn)因素相關(guān)，包括高血

2、壓、動脈粥樣硬化、糖尿病、房顫、吸煙所致的血管損害等等。更為有趣的是腦血管病的事件導(dǎo)致了損傷相關(guān)的分子模式(damageassociated molecular patterns，DAMPs)的釋放，從而增強(qiáng)了先天免疫反應(yīng)，最后導(dǎo)致腦損害和有關(guān)的神經(jīng)功能的缺失。
　　目前公認(rèn)的急性缺血性腦卒中的有效的治療方法是在有效的時(shí)間窗內(nèi)盡早恢復(fù)腦灌注，如臨床上應(yīng)用重組組織型纖溶酶原激活劑(recombinant tissueplasmino

3、gen activator，rTPA)進(jìn)行超早期靜脈溶栓，臨床效果好，但是卻受治療時(shí)間窗、病人的一般情況及溶栓后容易并發(fā)出血等的各種并發(fā)癥的多種因素的制約，所以只有大約不到20％的病人能獲益，盡早恢復(fù)腦灌注在臨床的實(shí)際治療中存在困難。尋求有效的腦保護(hù)治療成為多年研究的重點(diǎn)。幾十年來大量的研究者專注于的細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制的研究，使腦細(xì)胞在缺血缺氧應(yīng)激后仍能保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的動態(tài)平衡，從而保護(hù)腦細(xì)胞不被破壞。實(shí)驗(yàn)在動物體內(nèi)均獲得很好的成效，但在

4、臨床轉(zhuǎn)化研究中卻均失敗。盡管如此，在國際卒中組織的努力下，卒中的病理發(fā)展過程方面的研究仍有很大的進(jìn)步。
　　炎性小體（Inflammasomes）是一種多蛋白復(fù)合體，作為先天免疫的一部分可以在應(yīng)激和感染等感受到外界信號刺激的情況下激活半胱天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)，從而產(chǎn)生白介素1β（IL-1β）和白介素18(IL-18)。Caspase-1和IL-1β增強(qiáng)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡，IL-1β在很多疾病包括腦缺血性損害

5、過程中起重要作用，其機(jī)制尚未揭示。在卒中實(shí)驗(yàn)中，隨著腦缺血的發(fā)生，IL-1β的表達(dá)增多，而且多個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，阻止IL-1β的產(chǎn)生具有腦保護(hù)作用。值得注意的是人類的缺血性腦卒中血液和腦脊液中均可發(fā)現(xiàn)IL-1β的水平增高。在鼠模型中，腦缺血性損害后炎性小體相關(guān)蛋白水平增高，降低炎性小體相關(guān)蛋白水平可以減輕損害的程度。
　　受損的細(xì)胞，包括神經(jīng)細(xì)胞可以釋放出三磷酸腺苷(ATP)、尿苷三磷酸(UTP)，激活小膠質(zhì)細(xì)胞或巨噬細(xì)胞上的離子通道P

6、2X7受體，從而導(dǎo)致炎癥因子前體的產(chǎn)生。Caspase1嵌合在大分子蛋白NLRP3上，在Caspase1的作用下，成熟的IL-1β、IL-18由其前體轉(zhuǎn)化而來。缺血損害以及細(xì)胞的死亡導(dǎo)致了DAMPs的形成。DAMPs包括高遷移率族蛋白1(HMGB1)、熱休克蛋白HSP60、Aβ等，可以作用于細(xì)胞表面的Tool樣受體(TLR)，從而使炎性前體的基因表達(dá)增多。細(xì)胞因子的產(chǎn)生及補(bǔ)體的形成引起了白細(xì)胞浸潤的增加，擴(kuò)大了腦的損害，這樣能產(chǎn)生更多的

7、DAMPs，進(jìn)一步加重?fù)p害。同時(shí)由損害細(xì)胞釋放的抗原也激活T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性的免疫。這些近期的發(fā)展使得需要再評估炎癥和免疫在卒中病理生理過程中的作用。
　　2009年諾貝爾獎(jiǎng)的獲得者發(fā)現(xiàn)了染色體末端的端粒帽端粒帽能保護(hù)染色體防止其融合、降解和重組等，為衰老和癌癥的研究奠定了基礎(chǔ)。哺乳動物的端粒由TTAGGG堿基對組成，這些堿基對從死亡的宿主細(xì)胞中釋放并且能減輕引起組織損害的炎癥反應(yīng)。合成的寡核苷酸A151是由四個(gè)TTAGGG堿基對

8、結(jié)合在硫代磷酸酯骨架上構(gòu)成。A151復(fù)制了端粒DNA調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的能力，包括調(diào)節(jié)白介素6(IL-6)、白介素12（IL-12）、γ干擾素(IFNγ)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2（MIP-2）和腫瘤壞死因子α(TNFα)的產(chǎn)生。A151作為一種的抗炎癥反應(yīng)制劑，其治療潛能已經(jīng)在關(guān)節(jié)炎、內(nèi)毒素休克、刀豆蛋白A誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎、眼部炎癥、狼瘡腎炎、動脈粥樣硬化和二氧化硅所致的肺部炎癥等動物模型中得到證實(shí)。至關(guān)重要的是，硫代磷酸寡核苷酸的的藥效學(xué)和安全

9、性已經(jīng)在多個(gè)臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)。
　　A151對腦缺血后的炎癥免疫反應(yīng)的影響以及對腦缺血是否具有保護(hù)作用目前尚無人研究，基于IL-1β在腦缺血性損害中的作用以及A151成功改進(jìn)多種疾病炎性因子的基礎(chǔ)上，如果A151能減輕腦缺血后的炎癥免疫反應(yīng)，并對腦缺血損害具有保護(hù)作用，將為缺血性腦卒中的治療提供新的亮點(diǎn)。
　　腦缺血損害時(shí)，骨髓巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞是IL-1β的主要來源。腦缺血后，除了血管周圍的巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞迅速滲入大

10、腦也成為巨噬細(xì)胞。所以本實(shí)驗(yàn)選用骨髓巨噬細(xì)胞在細(xì)菌脂多糖(LPS)和糖氧剝奪(OGD)雙重處理來模擬腦內(nèi)缺血缺氧狀態(tài)。
　　易卒中自發(fā)性高血壓大鼠(SHR-SP大鼠)生存期短，易發(fā)卒中，是研究腦卒中最為理想的動物模型。本實(shí)驗(yàn)采用SHR-SP大鼠的永久性大腦中動脈離斷手術(shù)模型進(jìn)行研究。
　　本實(shí)驗(yàn)所應(yīng)用的A151及對照劑寡核苷酸C151（5'-TTCAAATTCAAATTCAAATTCAAA-3'）由美國食品藥物管理局(FDA

11、)生物制品評價(jià)和研究中心(CBER)提供。
　　目的：
　　1.體外部分:將骨髓巨噬細(xì)胞予以LPS和OGD的雙重協(xié)同處理，以求模擬腦內(nèi)的缺血缺氧的環(huán)境，檢測A151在缺氧缺糖損害后的骨髓巨噬細(xì)胞的免疫炎癥反應(yīng)中的作用，能否減少炎性因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)從而并減輕細(xì)胞的損害。
　　2.體內(nèi)部分:應(yīng)用SHR-SP大鼠的永久性大腦中動脈離斷手術(shù)模型，將從動物的行為、組織、免疫、基因等水平分別來觀察A151對發(fā)生卒中后的SH

12、R-SP大鼠的炎性因子的影響以及對腦組織的保護(hù)作用，觀察其治療潛能，以求進(jìn)一步的腦保護(hù)作用。
　　方法：
　　1.骨髓巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)，取SHR-SP大鼠的股骨脛骨，沖洗骨髓腔，將得到的細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)，并應(yīng)用巨噬細(xì)胞特異性蛋白抗體染色，在熒光顯微鏡下確定99％以上的細(xì)胞都是BMDM細(xì)胞。
　　2.應(yīng)用A151、C151、LPS預(yù)處理骨髓巨噬細(xì)胞后，行OGD實(shí)驗(yàn)，18小時(shí)后收取上清及細(xì)胞留用。一部分上清用于做酶聯(lián)免疫吸附

13、測定((enzyme linked immunosorbent assay，Elisa)，一部分上清濃縮后測量蛋白濃度，和收集的裂解的細(xì)胞蛋白一起進(jìn)行免疫印記實(shí)驗(yàn)(Western blot)。
　　3.應(yīng)用A151、C151、生理鹽水分別預(yù)處理SHR-SP大鼠，對大鼠行永久性大腦中動脈離斷手術(shù)，術(shù)后48小時(shí)進(jìn)行神經(jīng)功能評分，處死大鼠，收集腦、脾、腎血液等組織留用。
　　4.收集的一部分大腦切片染色，應(yīng)用Image J(NIH

14、，Bethesda，MD)軟件測量大鼠的腦梗死體積。
　　5.一部分腦組織提取RNA，做Real-time PCR，檢測腦中NLRP3、Aim2、NLRP4的mRNA的表達(dá)。
　　6.收集的血液進(jìn)行抗凝處理，一部分進(jìn)行血液化學(xué)物質(zhì)檢測以及血細(xì)胞計(jì)數(shù)，另一部分離心后收集血漿進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測。
　　7.收集的一部分腦及脾組織裂解后測量蛋白濃度，做Western blot以及Elisa。
　　8.應(yīng)用JC-1試劑盒觀察

15、線粒體膜電位。
　　結(jié)果；
　　1.A151能夠明顯減少細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的IL-1β、IL-1α、IL-6、CINC1和TNFγ的水平，和對照組的ODN C151相比，C151只能減少IL-6、CINC1的水平，對其他因子沒有影響。A151能夠明顯提高缺血缺氧狀態(tài)下BMDM的存活率。這一結(jié)果也證實(shí)了其他研究者提出的A151在炎癥細(xì)胞因子的中的作用并沒有細(xì)胞毒性作用的說法。
　　2.通過蛋白免疫印跡法來進(jìn)一步檢測A151

16、在IL-1β的成熟和表達(dá)中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)A151可以減少用OGD處理后的BMDM的培養(yǎng)液上清中的成熟的IL-1β的表達(dá)。而且A151減少了成熟的caspasel和NLRP3以及iNOS的表達(dá)，但是A151對ASC，AIM2,NLRP1和NLRC4沒有影響。
　　3.線粒體功能障礙與NLRP3炎性小體的激活有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)通過JC-1試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)A151能減輕線粒體膜的去極化從而減少細(xì)胞的死亡。
　　4.在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用永久性大腦

17、中動脈離斷手術(shù)模型研究A151的治療潛能作用發(fā)現(xiàn)，與C151組和生理鹽水組相比較，術(shù)前三天，術(shù)前一天以及術(shù)后三小時(shí)腹腔注射A151組的腦梗死體積均顯著縮小，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.提取術(shù)后48小時(shí)后SHR SP大鼠的腦組織的RNA，做Real-time PCR發(fā)現(xiàn)A151處理后的NLRP3的mRNA的表達(dá)明顯減少，而Aim2和NLRP4的mRNA的表達(dá)無明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1.A151減少LPS和OGD處理后

18、的BMDM的死亡及炎性因子的釋放。
　　2.A151可以減少OGD和LPS的處理下的BMDM內(nèi)的成熟的IL-1β和caspasel，并且能夠減少NLRP3 and iNOS的表達(dá)。
　　3.A151能減輕BMDM細(xì)胞的線粒體膜的去極化。
　　4.A151可以減輕永久性大腦中動脈離斷手術(shù)的SHR-SP大鼠的腦的缺血性損害。
　　5.A151能減少永久性大腦中動脈離斷手術(shù)的SHR-SP大鼠的腦內(nèi)的NLRP3的mRNA