Sam68對(duì)T-ALL細(xì)胞增殖和凋亡的作用研究.pdf

1、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)是一種遺傳異質(zhì)性疾病，以骨髓、外周血和其他器官中未成熟淋巴細(xì)胞增殖為特征，ALL通過淋巴細(xì)胞表面抗原來進(jìn)行免疫學(xué)分型，大致可分為前B細(xì)胞ALL，成熟B細(xì)胞ALL和T細(xì)胞ALL。T細(xì)胞ALL(T-ALL)是起源于T細(xì)胞淋巴母細(xì)胞的遺傳異質(zhì)性疾病，發(fā)生于骨髓，外周血或胸腺，淋巴結(jié)和結(jié)外組織。表達(dá)不成熟T細(xì)胞免疫表型，最常見免疫抗原為CD3，包括胞漿CD3和細(xì)胞表面CD3。T-ALL患者腫瘤細(xì)胞停滯在不同分化階段，

2、根據(jù)不同免疫表型分為四類:早期前體T-ALL，前體T-ALL，皮質(zhì)T-ALL和髓質(zhì)T-ALL。與B-ALL患者比較，T-ALL患者預(yù)后較差，近年隨著化療的進(jìn)展，兒童T-ALL患者治愈率接近75％，成年患者為50％。這種提高主要?dú)w功于對(duì)該病的分子遺傳學(xué)和病理學(xué)的深入理解，根據(jù)危險(xiǎn)分層調(diào)整的治療和新型靶向藥物的出現(xiàn)。但耐藥或復(fù)發(fā)的T-ALL患者預(yù)后仍然很差。深入研究急性淋巴白血病發(fā)生發(fā)展過程中的分子機(jī)制有助于血液腫瘤的臨床治療。在T-ALL

3、形成中，不同基因水平的變化協(xié)同作用更改了胸腺內(nèi)T細(xì)胞異常生長(zhǎng)、增殖、凋亡、分化的過程。多種癌基因和功能性失活突變共同參與其發(fā)生發(fā)展。T-ALL病理發(fā)展過程的遺傳多變性進(jìn)一步體現(xiàn)在一些普遍存在的細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)的改變，從而引起特定生物進(jìn)程的變化，如細(xì)胞周期信號(hào)傳導(dǎo)通路，細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，染色體重組，T細(xì)胞分化和自我更新等。
　　Sam68(Src-associated in mitosis68 kDa)屬于STAR家族，具有KH

4、、SH3等多種結(jié)構(gòu)域，既是一種RNA結(jié)合蛋白，又是銜接蛋白，通過與多種蛋白和RNA相互結(jié)合，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA轉(zhuǎn)錄后修飾等分子進(jìn)程，在細(xì)胞增殖、凋亡及自噬等多種細(xì)胞行為中發(fā)揮重要作用。研究表明Sam68基因的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，Sam68不僅在多種腫瘤中表達(dá)增高，與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡等關(guān)系密切，其在乳腺癌、腎癌等多種實(shí)體瘤細(xì)胞中的表達(dá)異常身高與臨床不良預(yù)后有關(guān)。此外，Sam68參與T細(xì)胞活化，參與TCR信號(hào)轉(zhuǎn)

5、導(dǎo)通路，甚至可能促進(jìn)混合型白血病的惡性轉(zhuǎn)化。但是目前Sam68基因在急性T淋巴細(xì)胞白血病中的作用尚未見報(bào)道。Sam68的表達(dá)是否與T-ALL的發(fā)生、發(fā)展和維持有關(guān)，以及其在T-ALL中作用的分子機(jī)制需要進(jìn)一步探索。
　　目的：
　　以急性T-ALL患者骨髓細(xì)胞和T-ALL細(xì)胞系Jurkat、CCRF-CEM為研究對(duì)象，探討Sam68異常表達(dá)對(duì)T-ALL的影響，在此基礎(chǔ)上研究相關(guān)調(diào)控機(jī)制，為理解T-ALL的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治

6、療靶點(diǎn)提供更多研究基礎(chǔ)。
　　方法：
　　對(duì)2014年6月～2015年4月中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院收治32例T-ALL患者骨髓標(biāo)本進(jìn)行研究，并收集9例正常人骨髓標(biāo)本為對(duì)照。分離單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)Sam68基因的表達(dá)水平。
　　1.應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法和Western Blot檢測(cè)T-ALL細(xì)胞系Jurkat和CCRF-CEM中Sam68表達(dá)水平。
　　2.利用RNA干擾技

7、術(shù)，構(gòu)建靶向Sam68的特異性干擾載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Jurkat和CCRF-CEM細(xì)胞，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Sam68表達(dá)水平。利用pLKO-Tet-On質(zhì)粒對(duì)目的質(zhì)粒敲降作用需強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的特性，去除強(qiáng)力霉素后檢測(cè)Sam68恢復(fù)效率。利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法和Western Blot檢測(cè)Sam68表達(dá)調(diào)控效率。
　　3.采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Sam68表達(dá)變化對(duì)Jurkat和CCRF-CEM細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性的影響，利用細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Sam

8、68表達(dá)變化對(duì)Jurkat和CCRF-CEM細(xì)胞的單細(xì)胞克隆增殖能力。利用Hoechst染色、AnnexinⅤ/FITC-PI雙染方法檢測(cè)Sam68表達(dá)變化對(duì)Jurkat和CCRF-CEM凋亡情況的影響。利用Western Blot檢測(cè)Sam68表達(dá)變化對(duì)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響以及AKT/mTOR通路信號(hào)分子表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.32例T-ALL患者中Sam68mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組。

9、>　　2.T-ALL相關(guān)Jurkat和CCRF-CEM細(xì)胞中Sam68mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照。
　　3.成功構(gòu)建了利用shRNA干擾技術(shù)導(dǎo)致Sam68敲降的穩(wěn)定Jurkat和CCRF-CEM細(xì)胞系，且Sam68表達(dá)可隨強(qiáng)力霉素去除而恢復(fù)。
　　4.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Sam68敲降后Jurkat和CCRF-CEM細(xì)胞生長(zhǎng)增殖活性受到抑制，Sam68恢復(fù)后Jurkat和CCRF-CEM受抑制增殖情況明顯改善。細(xì)胞

10、集落實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Sam68敲降后Jurkat和CCRF-CEM細(xì)胞的克隆形成能力下降，Sam68恢復(fù)后下降的克隆形成情況明顯改善。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Sam68敲降后Jurkat和CCRF-CEM細(xì)胞凋亡明顯增加，Sam68恢復(fù)后凋亡水平下降。伴隨Sam68敲降所致上述功能變化，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21表達(dá)上調(diào)，CDK2表達(dá)下降，凋亡相關(guān)蛋白Bad表達(dá)上調(diào)，Bcl-xl下調(diào)，caspase-3，caspase-9，PARP的剪切活化程度明

11、顯增加，AKT/mTOR信號(hào)通路中，p-AKT，p-FOXO1，mTOR和p-p70S6k水平明顯下調(diào)，而總的AKT，F(xiàn)OXO1和p70S6k水平無明顯變化。去除強(qiáng)力霉素和恢復(fù)Sam68表達(dá)后，上述蛋白均明顯恢復(fù)，與陰性對(duì)照差異不顯著，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　T-ALL患者、Jurkat和CCRF-CEM細(xì)胞株中均存在Sam68表達(dá)異常增高，提示Sam68可能參與T-ALL病理過程。Sam68表達(dá)變化引起了T-ALL