Chk1介導(dǎo)的CCNB1高表達在結(jié)直腸癌中的作用及機制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的主要惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率在女性惡性腫瘤中高居第二位、男性中高居第三位，僅次于肺癌和乳腺癌。每年全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例超過136萬，死亡病例約69萬。在我國，其發(fā)病率隨著人民生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)向高脂高蛋白低纖維素方向變化而逐年上升，結(jié)直腸癌已成為我國近30年來發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤。隨著近年來醫(yī)學(xué)水平的不斷進步，人們對于結(jié)直腸癌的治療水平也有了長足的發(fā)展，目前關(guān)于結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及浸潤、擴散、轉(zhuǎn)

2、移機制研究方興未艾。
　　結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個極復(fù)雜的過程，不僅與環(huán)境、飲食及生活習(xí)慣等各種外在因素有關(guān)，其內(nèi)在更是一個多階段、多步驟、多基因參與的復(fù)雜過程。盡管在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中有大量的分子事件被發(fā)現(xiàn)，這些分子事件在這一過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，但這些分子事件在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用尚未完全清楚。
　　細胞周期素B1(CCNB1)是細胞周期蛋白家族中一個重要的成員，是細胞G2/M檢測點有關(guān)的重要細胞周期

3、調(diào)控因子。它的一個重要角色就是調(diào)節(jié)細胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)并與之形成復(fù)合體后使底物磷酸化，啟動細胞從G1/S期進入G2/M期，并促進有絲分裂。越來越多的證據(jù)表明CCNB1參與了細胞周期檢測點的控制，它的功能障礙是腫瘤發(fā)生中的早期事件，在人類許多腫瘤中可以觀察到其失調(diào)控表達，包括乳腺癌、宮頸癌、肺癌等。同時，有證據(jù)表明抑制CCNB1的表達可以使乳腺癌細胞對化療更加敏感。此外，研究表明在腫瘤細胞中野生型P53通過SP1轉(zhuǎn)錄因子抑

4、制CCNB1的轉(zhuǎn)錄表達。在結(jié)直腸癌細胞株HCT116 p53+/+細胞中CCNB1的蛋白水平呈低表達，而在HCT116 p53-/-細胞中呈高表達。這些研究表明CCNB1在腫瘤發(fā)展中潛在的關(guān)鍵作用，然而，CCNB1在結(jié)直腸癌中的具體功能機制尚未可知。
　　大部分癌癥被認為高度依賴于細胞周期檢查點激酶1(Chk1)的異常表達，并且CCNB1在以前是被作為預(yù)測Chk1抑制劑的療效的生物標(biāo)記物。目前對于CCNB1和Chk1各自在腫瘤中的

5、表達機理及臨床意義的研究較多，但對二者在結(jié)直腸癌中是否存在相關(guān)性以及二者通過何種途徑共同影響結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展方面的研究仍不清楚。
　　本研究通過檢測CCNB1、Chk1在結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸組織標(biāo)本中的表達情況、分析其相關(guān)性，并通過體外細胞功能實驗驗證Chk1是CCNB1的正向調(diào)控因子，同時結(jié)合體內(nèi)外實驗深入探索CCNB1對結(jié)直腸癌細胞生物學(xué)行為的影響，探討其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的具體作用機制。本研究旨在揭示結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的新機制

6、，并為探尋結(jié)直腸癌防治新策略提供堅實可靠的實驗證據(jù)和理論支持。
　　第一部分 CCNB1在結(jié)直腸癌中的表達及功能研究
　　目的:
　　驗證CCNB1在結(jié)直腸癌組織中表達升高，明確CCNB1對結(jié)直腸癌細胞增殖、周期、凋亡等生物學(xué)行為的影響。
　　方法:
　　收集結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本，采用實時熒光定量PCR(quantitativereal-time RT-PCR，qRT-PCR)法檢測30對結(jié)直腸癌

7、組織及癌旁正常組織的CCNB1mRNA和蛋白的表達水平。分別選取P53-wild HCT116、P53-mutant SW480和P53-null HCT116細胞株作為實驗對象，利用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)分別轉(zhuǎn)染CCNB1特異性siRNA或陰性對照siRNA，并采用MTT法檢測腫瘤細胞的增殖能力、PI單染檢測細胞周期分布、Annexin-Ⅴ聯(lián)合PI法檢測細胞凋亡、western blot檢測CCNB1調(diào)控的下游周期蛋白及凋亡蛋白表達。
　

8、　結(jié)果:
　　1.CCNB1在結(jié)直腸癌組織中的表達較癌旁正常組織顯著升高。
　　2.在結(jié)直腸癌細胞株P(guān)53-wild HCT116、SW480和P53-null HCT116中，抑制CCNB1的表達均能能抑制腫瘤細胞的增殖，并能通過調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)分子CDK1/CDC25C促使細胞周期發(fā)生G2/M期阻滯。
　　3.在P53-wild HCT116細胞中抑制CCNB1表達能夠通過調(diào)節(jié)p53/Bax通路促使腫瘤細胞發(fā)生早期

9、凋亡，而在P53-null HCT116細胞中抑制CCNB1表達也能通過非p53途徑促進腫瘤細胞發(fā)生早期凋亡。
　　結(jié)論:
　　1.CCNB1在結(jié)直腸癌組織中表達顯著升高。
　　2.下調(diào)CCNB1的表達可抑制結(jié)直腸癌細胞增殖、誘導(dǎo)細胞周期G2/M期阻滯和促進腫瘤細胞凋亡，提示CCNB1在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中發(fā)揮致癌作用。
　　第二部分 結(jié)直腸癌CCNB1高表達依賴-細胞周期檢查點激酶1(Chk1)的表達
　　

10、目的:
　　確定Chk1是CCNB1的上游調(diào)控分子，揭示Chk1在結(jié)直腸癌中的作用機制。
　　方法:
　　首先，分別在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中用qRT-PCR法檢測Chk1 mRNA的表達水平，western blot法檢測Chk1的蛋白表達水平，分析與CCNB1的組織相關(guān)性。其次，利用siRNA特異性干擾結(jié)直腸癌細胞中Chk1的表達，western blot檢測CCNB1的蛋白表達，MTT法檢測腫瘤細胞的增殖能力

11、，明確Chk1在結(jié)直腸癌中的作用和對CCNB1的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　1.Chk1在結(jié)直腸癌組織中的表達水平均較癌旁正常組織明顯增高，并與CCNB1表達水平呈顯著正相關(guān)。
　　2.干擾結(jié)直腸癌細胞Chk1的表達可抑制CCNB1的蛋白水平，細胞增殖能力受阻。
　　結(jié)論:
　　Chk1在結(jié)直腸癌中靶向調(diào)控CCNB1的表達，提示Chk1是CCNB1的上游調(diào)控分子。
　　第三部分 慢病毒介導(dǎo)的CCNB1

12、 shRNA對結(jié)直腸癌裸鼠移植瘤生長抑制作用的研究
　　目的:
　　明確持續(xù)抑制CCNB1表達對裸鼠移植瘤生長的調(diào)控作用。
　　方法:
　　首先構(gòu)建含特異性靶向CCNB1基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)慢病毒表達載體，將慢病毒分別轉(zhuǎn)導(dǎo)HCT116和SW480細胞株，通過抗生素篩選后得到各自的CCNB1穩(wěn)定低表達細胞株，western blot法檢測CCNB1的表達水平以明確穩(wěn)篩效率。將上述穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株及相對應(yīng)的慢病

13、毒空載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照組細胞株分別接種于裸鼠皮下，觀察成瘤及移植瘤生長情況，免疫組織化學(xué)染色方法檢測移植瘤中CCNB1的表達，western blot檢測移植瘤中與CCNB1的下游分子，包括CDC25C、CDK1、p53和Bax的表達。
　　結(jié)果:
　　1.抑制CCNB1的表達可抑制裸鼠移植瘤的生長速度。
　　2.在移植瘤中抑制CCNB1表達能夠抑制CCNB1下游細胞周期相關(guān)蛋白CDC25C和CDK1的表達下降，在HCT1