人TSHβ新剪接變體生物學(xué)特性探討.pdf

1、目的：
　　促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone，TSH)是調(diào)控甲狀腺功能的關(guān)鍵蛋白，TSH由α亞基和β亞基通過非共價(jià)鍵連接組成，β亞基具有激素特異性。2009年Vincent等報(bào)道了第一個(gè)功能性TSHβ剪接變體，TSHβ新剪接變體在免疫-神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)中可能具有不同于天然型TSHβ的調(diào)控作用。由于該TSHβ剪接變體是新近才被發(fā)現(xiàn)的，所以目前對其基本生物學(xué)特性、表達(dá)調(diào)控機(jī)制及與甲狀腺相關(guān)疾病相關(guān)性等

2、均不清楚。本研究擬從上述幾個(gè)方面對這個(gè)TSHβ新剪接變體進(jìn)行逐步深入的探討。
　　方法：
　　1.TSHβ剪接變體在正常人外周血中的研究：對血清樣品進(jìn)行鹽析、透析和濃縮預(yù)處理后采用免疫沉淀法鑒定人血清中是否存在TSHβ剪接變體蛋白；運(yùn)用RT-PCR和Western Blot方法分別從轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平檢測人外周血白細(xì)胞(peripheral blood leukocyte，PBL)中TSHβ剪接變體表達(dá)情況；制作人PBL涂片

3、，運(yùn)用免疫熒光染色檢測人PBL中TSHβ剪接變體的表達(dá)。
　　2.人TSHα與TSHβ剪接變體體外結(jié)合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建pSELECT-GFPzeo-TSHβ剪接變體和pcDNA3.1D/V5-His-TOPO-TSHα兩個(gè)重組表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞系，建立能穩(wěn)定表達(dá)TSHβ剪接變體和TSHα的CHO細(xì)胞系，將上述兩種CHO細(xì)胞系混合培養(yǎng)后，取培養(yǎng)上清，利用免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證人TSHα是否能與TSHβ剪接變體形成二聚體。

4、>　　3.不同病理生理?xiàng)l件對TSHβ剪接變體表達(dá)影響：定量PCR檢測GD和HT患者PBL中TSHβ剪接變體的表達(dá)差異；分離培養(yǎng)人PBL，分別給予致炎因子LPS(10mg/L)、抗炎因子地塞米松(10-6，10-7 and10-8M)、TRH(100nM)和T3(100nM)直接刺激，定量PCR技術(shù)檢測人PBL中TSHβ剪接變體mRNA表達(dá)差異。
　　4.人TSHβ新剪接變體蛋白的原核表達(dá)及純化：采用PET高效大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對人T

5、SHβ剪接變體進(jìn)行表達(dá)并利用免疫親和層析技術(shù)純化獲得重組人TSHβ剪接變體蛋白。
　　結(jié)果：
　　1.鑒定出人血清中存在TSHβ剪接變體蛋白，正常人PBL僅表達(dá)TSHβ剪接變體而不表達(dá)天然型TSHβ，免疫熒光染色顯示人PBL中有TSHβ剪接變體陽性表達(dá)細(xì)胞。
　　2.成功構(gòu)建pSELECT-GFPzeo-TSHβ剪接變體和pcDNA3.1D/V5-His-TOPO-TSHα兩個(gè)重組表達(dá)載體；建立能穩(wěn)定表達(dá)TSHβ剪接變

6、體和TSHα的CHO細(xì)胞系；免疫共沉淀技術(shù)證實(shí)人TSHα能與TSHβ剪接變體形成二聚體。
　　3.TSHβ剪接變體在GD和HT患者PBL中的表達(dá)差異：與正常人相比，HT初發(fā)患者(未經(jīng)任何藥物治療)PBL中TSHβ剪接變體mRNA表達(dá)量上調(diào)123.33％(n=10，P<0.0001)、發(fā)病初期曾使用強(qiáng)的松治療3個(gè)月但病程>18個(gè)月的HT患者PBL中TSHβ剪接變體mRNA表達(dá)量上調(diào)76.67％(n=5，P=0.023)而發(fā)病初期曾使

7、用強(qiáng)的松治療3個(gè)月，病程≤9個(gè)月的HT患者PBL中TSHβ剪接變體mRNA表達(dá)量下調(diào)40％(n=8，P<0.0001)。GD初發(fā)患者PBL中TSHβ剪接變體mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.0001)。人PBL中TSHβ剪接變體mRNA表達(dá)水平與血清FT3水平負(fù)相關(guān)(r=-0.635，P<0.0001)、FT4水平負(fù)相關(guān)(r=-0.760，P<0.0001)、TSH水平正相關(guān)(r=0.975，P<0.0001)。
　　4.單次給予致炎因子

8、LPS刺激后，人PBL中TSHβ剪接變體mRNA表達(dá)變化趨勢是先增高后下降最后恢復(fù)至正常。與正常對照組相比，LPS處理6h組TSHβ剪接變體mRNA表達(dá)量增高(P=0.003)，LPS處理12h組TSHβ剪接變體mRNA表達(dá)量下降(P=0.008)，LPS處理24h、48h組TSHβ剪接變體mRNA表達(dá)量與正常對照24h、48h組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？寡滓蜃拥厝姿梢种芓SHβ剪接變體mRNA表達(dá)并呈時(shí)間濃度依賴性。
　　5.TRH

9、作用人PBL6h時(shí)，TSHβ剪接變體mRNA表達(dá)量增高(P<0.0001)，隨后逐漸恢復(fù)正常表達(dá)水平。T3作用人PBL12h時(shí)，TSHβ剪接變體mRNA表達(dá)量下降至最低(P=0.043)，12h后逐漸恢復(fù)正常表達(dá)水平。
　　6.成功構(gòu)建PET-28a-TSHβ剪接變體重組表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，免疫親和純化，最后獲得了7.4mgTSHβ剪接變體蛋白，純度大于90％。
　　結(jié)論：
　　(1)TSHβ剪接變體既可以存

10、在于外周血循環(huán)中，以遠(yuǎn)距分泌(telecrine)方式發(fā)揮生物學(xué)作用，也可以表達(dá)于免疫細(xì)胞，以旁分泌(paracrine)的方式發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。(2)人TSHα能與TSHβ剪接變體形成二聚體，該研究結(jié)果對于證明它的穩(wěn)定性和是否具有高度生物活性至關(guān)重要。(3)TSHβ剪接變體可能參與了HT患者的甲狀腺病理損傷。機(jī)體在不同狀態(tài)下，TSHβ剪接變體可能受HPT軸和/或免疫系統(tǒng)調(diào)控。(4)純化獲得的TSHβ剪接變體蛋白將為TSHβ剪接變體功能及調(diào)