人細(xì)胞中hIWS1因子生物學(xué)特性的研究.pdf

1、第二類(lèi)RNA聚合酶(RNApolymeraseⅡ，RNAPⅡ)主導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄延伸是一個(gè)高度調(diào)控的過(guò)程，其中涉及許多的調(diào)控因子參與RNAPⅡ活性的調(diào)控。目前已經(jīng)有許多的RNAPⅡ轉(zhuǎn)錄延伸因子被鑒定，但仍有不少的因子處于待了解狀態(tài)，酵母方面的研究認(rèn)為IWS1是一個(gè)新的RNAPⅡ轉(zhuǎn)錄延伸因子。本研究在人細(xì)胞中鑒定了hIWS1(humanIWS1)因子，并且在此基礎(chǔ)上，對(duì)hIWS1的一些生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。另外，PRMT5是蛋白質(zhì)

2、精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(proteinargininemethyltransferases,PRMTs)家族中一個(gè)重要的成員，它能夠?qū)彼?R)進(jìn)行單甲基化和對(duì)稱(chēng)性雙甲基化翻譯后修飾。最近有研究發(fā)現(xiàn)PRMT5能參與RNAPⅡ轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控。為此，本研究探索了人細(xì)胞中hIWS1與PRMT5的關(guān)系。 1.hIWS1的克隆、表達(dá)與鑒定 1.1從人的293T細(xì)胞中提取總RNA，將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成為第一鏈cDNA作為PCR擴(kuò)增hI

3、WS1cDNA的模板。然后根據(jù)GenBank中所預(yù)測(cè)的hIWS1的cDNA序列(登錄號(hào)：AL834178)設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR引物。利用這些特異性的引物，本研究擴(kuò)增得到hIWS1的N端(hIWS1-N391)和C端(hIWS1-C297)編碼cDNA，然后利用這兩個(gè)cDNA片段獲得了全長(zhǎng)hIWS1，經(jīng)測(cè)序證明克隆得到的hIWS1序列與GenBank中AL834178的序列完全一致。這表明人細(xì)胞中存在成熟的hIWS1的mRNA，并且mRNA成

4、熟過(guò)程中的剪接機(jī)制符合GenBank中所預(yù)測(cè)的情況。 1.2根據(jù)AL834178所預(yù)測(cè)的開(kāi)放性閱讀框(openreadingframe，ORF)，將hIWS1-N391克隆到pET-22b形成表達(dá)重組質(zhì)粒pET22b-N391，然后將pET22b-N391轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果表明，在大腸桿菌BL21(DE3)中pET22b-N391的表達(dá)產(chǎn)物主要在上清中；并且IPTG誘導(dǎo)以后，pET22b-N3

5、91在16℃表達(dá)16h能夠產(chǎn)生更高的產(chǎn)量。 將大腸桿菌破碎液的上清加入到Ni-NTA純化柱中，然后用含20mM咪唑的PBS充分洗滌后，最后用含100mM咪唑的PBS能純化得到質(zhì)量較好的pET22b-N391。 1.3將純化得到的hIWS1-N391蛋白免疫大白兔制備多克隆抗體，該抗體特異地識(shí)別AL834178所預(yù)測(cè)蛋白上的第3至391位氨基酸。用該抗體對(duì)HCT116細(xì)胞中總蛋白進(jìn)行western雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果有兩個(gè)蛋白被

6、特異性地識(shí)別，其中信號(hào)最強(qiáng)的蛋白大小約92kDa，與AL834178所預(yù)測(cè)蛋白的分子量一致。該結(jié)果證明人細(xì)胞中存在hIWS1蛋白因子，并進(jìn)一步表明該因子嚴(yán)格地遵循GenBank中AL834178所預(yù)測(cè)的ORF。 2.小鼠Iwsl(mIws1)的組織表達(dá)分析 由于hIWS1與它的小鼠同源物(mouseIWS1，mIWS1)具有很高的同源性(84％的相似性)，因此本研究利用小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象研究動(dòng)物中IWS1的組織表達(dá)分布情況。

7、首先從小鼠體內(nèi)分離出有關(guān)器官組織，其中包括大腦、心臟、肝臟、肺、脾臟、胃、腎臟、前列腺、睪丸、子宮、大腸與小腸。接著將這些器官組織中的總RNA提取出來(lái)并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以這些cDNA為模板進(jìn)行半定量RT-PCR分析。結(jié)果表明mIWS1是個(gè)組織器官普遍性表達(dá)的因子；并且在不同器官組織中的表達(dá)量差異較大，其中腎臟中表達(dá)量最高，其次是睪丸、大腸、小腸與脾臟，而心臟中的表達(dá)量最低。這些結(jié)果意味著IWS1對(duì)于動(dòng)物機(jī)體是個(gè)必需因子，并且它的功

8、能具有組織偏好性。 3.hIWS1的亞細(xì)胞定位 3.1將hIWS1的全長(zhǎng)cDNA構(gòu)建到綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP-C1中，然后將該重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HCT116和U2OS細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明GFP-hIWS1在細(xì)胞中表達(dá)后主要定位在細(xì)胞核中，說(shuō)明hIWS1因子是個(gè)核蛋白。 3.2針對(duì)hIWS1的核蛋白特性，對(duì)hIWS1因子的肽鏈序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在hIWS1因子的兩個(gè)功能域的銜接區(qū)(第350至557位氨

9、基酸之間)有幾個(gè)類(lèi)似核定位信號(hào)(nuclearlocalizationsignals，NLSs)的基序。為了檢驗(yàn)這個(gè)銜接區(qū)是否具有NLSs作用，將hIWS1cDNA的各種缺失突變體構(gòu)建到綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP-C1中，然后將這些重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HCT116。熒光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明GFP-N391分布在細(xì)胞核內(nèi)，而GFP-N355主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，這些結(jié)果表明在hIWS1因子的第356位至第391位氨基酸之間含有NLSs。類(lèi)似

10、地，GFP-C389定位在細(xì)胞核內(nèi)，而GFP-△WT(缺失第356至524位氨基酸)卻同時(shí)分布在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，這些結(jié)果表明hIWS1因子第389位氨基酸至第524位氨基酸之間也含有NLSs。 4.hIWS1因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 4.1參考AL834178的cDNA序列選擇3個(gè)靶序列，并設(shè)計(jì)成shRNA引物，然后將合成的引物克隆到shRNA表達(dá)載體pNeoU6+1上構(gòu)建成RNAi重組質(zhì)粒，分別命名為sh1，sh2和sh

11、3。為了粗略地估計(jì)這幾對(duì)shRNA的RNAi效果，將GFP-WT分別與sh1，sh2，sh3和空白對(duì)照shLF共轉(zhuǎn)染HCT116，結(jié)果表明這3對(duì)shRNA都具有RNAi效果，不過(guò)sh2的RNAi效果較弱，而sh1和sh3卻能夠很有效地抑制細(xì)胞中hIWS1的表達(dá)。 4.2用以上各種shRNAs和對(duì)照質(zhì)粒shLF轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，然后進(jìn)行細(xì)胞克隆試驗(yàn)。結(jié)果表明與對(duì)照shLF組相比，sh2組的細(xì)胞克隆數(shù)量略少；而sh1和sh3組的

12、細(xì)胞克隆數(shù)量卻劇烈減少，并且所生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆形態(tài)較小。Western雜交實(shí)驗(yàn)表明各組試驗(yàn)中細(xì)胞克隆的差異是由于細(xì)胞中hIWS1因子被特異地抑制所引起的。這些結(jié)果證明細(xì)胞中hIWS1因子表達(dá)量降低后會(huì)降低細(xì)胞的存活能力和生長(zhǎng)能力，表明hIWS1因子是細(xì)胞生存的必需因子。 5.hIWS1和PPMT5的關(guān)系 5.1用抗PRMT5抗體與抗hIWS1抗體對(duì)HCT116細(xì)胞中的總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，然后用抗hIWS1抗體對(duì)免疫共

13、沉淀結(jié)果進(jìn)行western雜交檢驗(yàn)。結(jié)果表明抗PRMT5抗體與抗hIWS1抗體都能沉淀分離出hIWS1因子，并且這種沉淀分離是特異的，因?yàn)榭瞻讓?duì)照和免疫前血清均不能將hIWS1因子沉淀出來(lái)。這些結(jié)果表明人細(xì)胞中hIWS1和PRMT5之間存在物理性結(jié)合。 5.2將抑制hIWS1表達(dá)的sh1、抑制PRMT5表達(dá)的shRM5以及對(duì)照shLF轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，然后分別用抗hIWS1抗體和抗PRMT5抗體進(jìn)行Western雜交檢驗(yàn)。結(jié)