氧化型低密度脂蛋白對胎盤生長因子及抑制劑的影響.pdf

1、炎癥在動脈粥樣硬化啟動和進展中發(fā)揮著重要作用，炎性標志物如CRP、IL-6等不僅僅可作為炎癥的評判指標，而且也可作為評價疾病危險分層的生物學(xué)指標。目前臨床工作中較為常見的評價急性冠脈綜合征危險分層的指標包括急性反應(yīng)期蛋白、肌鈣蛋白T或I、炎性因子、細胞黏附分子等。 反映心肌特異性損傷的指標－肌鈣蛋白，可以較可靠地預(yù)測ACS患者的危險分層。但磷酸激酶和肌紅蛋白對于預(yù)測危險分層的價值較前者明顯降低。通過Meta分析認為肌鈣蛋白可作為

2、預(yù)測急性心肌梗死和心源性猝死發(fā)生率的可靠指標，此外還有其它一些重要獨立指標，如：年齡、ST段抬高程度、出現(xiàn)心衰癥狀和體征等。同時發(fā)現(xiàn)在MI或猝死病人血清中肌鈣蛋白的表達量約為對照組的9倍，而且肌鈣蛋白可以反映心肌微小梗死。因此，許多學(xué)者強調(diào)肌鈣蛋白是預(yù)測ACS患者再次發(fā)生心血管事件的最有力的獨立指標。 盡管目前研究表明CRP等對臨床具有很大的指導(dǎo)意義，但由于上述指標存在不可避免的局限性，因此引出了一個新的生物學(xué)指標－胎盤生長因子

3、（PLGF）。 PLGF屬于VEGF家族成員，兩者在編碼血小板源性生長因子基因片斷約有50％同源性，除此以外該家族還包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。根據(jù)PLGF-mRNA剪接方式不同，認為PLGF目前最主要有三種異構(gòu)體，即PLGF-1（PLGF149），PLGF-2（PLGF170）和PLGF-3（PLGF221）。由于PLGF-2的第21位氨基酸羧基端的延伸使第Ⅵ外顯子存在故與肝素具有親和性，而PL

4、GF-1、PLGF-3則無此作用。PLGF最初發(fā)現(xiàn)是在胎盤組織中表達，對胎盤滋養(yǎng)細胞的增殖和分化起著一定的調(diào)節(jié)作用。后來發(fā)現(xiàn)在機體不同部位也監(jiān)測到PLGF表達，如心肺。 盡管PLGF屬于VEGF家族，但最新研究發(fā)現(xiàn)缺氧條件下VEGF可被激活，其表達增多是心肌缺血早期的調(diào)節(jié)，但PLGF的表達卻與VEGF截然不同，它在此過程中表達則為下調(diào)。但遺憾的是CAPTURE試驗對PLGF和VEGF關(guān)系，及PLGF和肌鈣蛋白關(guān)系均未給予明確的闡

5、述。需要對PLGF的生物學(xué)效應(yīng)做進一步研究。 VEGF家族的特異性受體包括VEGF-R1（Flt-1）和VEGF-R2（KDR1），它們所發(fā)揮的作用也不盡相同。在內(nèi)皮細胞表面，PLGF-1主要與VEGFR-1（Flt-1）結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，而PLGF-2還可與Neuropilin-1結(jié)合發(fā)揮作用。 P13激酶是PLGF介導(dǎo)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使細胞因子和炎性因子表達增多的一條重要的旁路途徑。該途徑包括依賴性和非依賴性兩種。P

6、13激酶依賴旁路主要是指ERK-1/2激活，而P13激酶非依賴旁路主要包括AP-1激活。進一步研究認為，一些轉(zhuǎn)錄因子如nuclearfactor-κB，AP-1，Egr-1，CREB-1等在PLGF誘導(dǎo)細胞因子表達過程中也發(fā)揮著一定的調(diào)節(jié)作用。 實驗表明，在內(nèi)皮細胞表面，VEGF介導(dǎo)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要是指PLC-1激活。以前的研究證明，PP2作為酪氨酸激酶抑制劑，可以阻斷腫瘤壞死因子的表達。故認為酪氨酸激活在腫瘤壞死因子表達途

7、徑中發(fā)揮作用。然而，在PLGF-1誘導(dǎo)白細胞介素-1和白細胞介素-8表達過程中如果阻斷酪氨酸激酶則可使這兩種炎性因子表達量較對照組增加50％。如果抑制p13激酶途徑，也可出現(xiàn)了相似的調(diào)節(jié)作用。因此表明，如果阻斷酪氨酸激酶通路可增加炎性因子的表達。 最近學(xué)者們通過不同低分子藥物阻斷劑試驗驗證PLGF通過特定的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮著一系列生物學(xué)效應(yīng)。阻斷MEK-1/2激酶可以降低炎性因子和細胞間黏附分子的mRNA表達

8、。而在PBMs和THP-1單核細胞中，如果應(yīng)用阻斷選擇性p38激酶的藥物，則不出現(xiàn)PLGF誘導(dǎo)細胞因子mRNA表達下降的結(jié)論。但在滋養(yǎng)細胞表面則可通過阻斷p38，而非MEK-1/2激酶來達到這種效應(yīng)。在人臍靜脈內(nèi)皮細胞則是MEK-1/2激酶細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在發(fā)揮作用。在單核細胞表面，PLGF誘導(dǎo)細胞信號通路即MEK激酶磷酸化，且可通過Flt-1抗體阻斷MEK激酶磷酸化過程。而磷酸酶C和p13激酶/AKT缺失也可阻斷MEK激酶磷酸化，繼而導(dǎo)致

9、PLGF作為單核細胞誘導(dǎo)劑促進細胞增殖、聚集及上調(diào)炎性因子表達的生物學(xué)作用消失。因此，PLGF介導(dǎo)的ERK-1/2的激活，F(xiàn)lt-1、磷酸酶C和p13激酶/AKT起到重要的輔助作用。 研究目的： 通過人人臍靜脈內(nèi)皮細胞（ECV-304）模型，探討正常情況下及氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）損傷后對胎盤生長因子-1（PLGF-1）誘導(dǎo)一氧化氮和炎性因子及內(nèi)皮細胞黏附分子的釋放的影響，并建立PLGF濃度和NO及細胞因子表達

10、量的關(guān)系曲線。當給予PLGF-1特異性的拮抗劑2-氨基-3-甲氧黃酮（PD98059）后觀察其作用。 材料與方法： 1、細胞處理：應(yīng)用不同濃度的PLGF-1（20、40、80ug/L）孵育ECV-304。根據(jù)PLGF-1的濃度將其分為對照組和PLGF-1干預(yù)組（20、40、80ug/L），3、6、12、24h后收集細胞上清液。應(yīng)用拮抗劑PD98059（100umol/L）和PLGF-1（80ug/L）刺激ECV-304，

11、分為空白對照組、ox-LDL組、PLGF-1+ox-LDL組和PLGF-1+ox-LDL+PD98059組（拮抗組），6h后收集細胞上清液，1500r/min，離心10min，去除細胞碎片待測。 2、干預(yù)試劑的配置：根據(jù)實驗需求，將干預(yù)試劑調(diào)配為實驗所需濃度。 3、細胞因子的表達：細胞因子的表達可在細胞上清液中監(jiān)測到。當使用不同濃度的PLGF-1干預(yù)后，在不同時間點收集細胞上清液，通過1000轉(zhuǎn)/分離心，10分鐘后，細胞

12、上清液收集保存于-20℃冰箱中，使用時再取出。炎性因子和細胞黏附分子可使用雙抗體夾心ELISA法進行監(jiān)測，建立標準曲線，按照說明書要求加入抗體，室溫靜置、充分洗板，最終應(yīng)用軟件得出數(shù)據(jù)。白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）濃度以pg/mL表示，金屬基質(zhì)蛋白酶-2（metalmatrixprotease-2，MMP-2）、可溶性細胞間黏附分子（solubleintercellularadhesionmolecule-1，

13、sICAM-1）、可溶性血管細胞間黏附分子（solublevascular-cellularadhesionmolecule-1，sVCAM-1）濃度以ng/mL表示。 4、NO的表達：NO的表達可在細胞上清液中監(jiān)測到。當使用不同濃度的PLGF-1干預(yù)后，在不同時間點收集細胞上清液，通過1000轉(zhuǎn)/分離心，10分鐘后，細胞上清液收集保存于-20℃冰箱中，使用時再取出。NO可使用硝酸鹽還原酶法進行監(jiān)測，其濃度以umol/L表示。

14、 5、統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所得數(shù)據(jù)用x±s表示，不同四組間比較應(yīng)用完全隨機的方差分析。當四組總體方差齊性時，兩兩組間比較應(yīng)用Bonferroni法檢驗，若總體方差不齊時，兩兩組間比較應(yīng)用Dunnett'sT3法檢驗。應(yīng)用重復(fù)測量的方差分析觀察不同時間點和不同濃度間的主效應(yīng)和交互效應(yīng)。認為P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： ①PLGF-1誘導(dǎo)一氧化氮的表達PLGF可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞產(chǎn)生

15、NO；不同濃度的PLGF-1（0ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL）對ECV-304干預(yù)后，NO的表達量也不同（P=0.000），表現(xiàn)為隨濃度增加呈增多趨勢。兩兩比較，當t=24h，PLGF-1（40ng/mL）組和PLGF-1（80ng/mL）組NO表達量無顯著性差異（P=0.085），余組差異則具有統(tǒng)計學(xué)意義。（P<0.01）；不同時間點（3h、6h、12h、24h）NO的表達量也不同（P=0.000），且當

16、作用6h時達較理想的分泌量。兩兩比較，對照組，3h和24h點NO分泌量無顯著性差異（P=0.143），PLGF-1（20ug/mL）組，12h和24h點NO分泌量無顯著性差異（P=0.520），PLGF-1（80ug/mL）組，3h和6h點NO分泌量無顯著性差異（P=0.06），其它不同時間點均有顯著性差異（P<0.05）。 PLGF-1誘導(dǎo)炎癥因子和內(nèi)皮細胞黏附分子的表達隨著濃度（20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL

17、）的增多而增多，隨時間（3h、6h、12h、24h）的延長而增多，6h炎性因子達較理想的分泌量。 ②當t=6h，不同處理組間炎性因子和內(nèi)皮細胞粘附分子的表達具有顯著性差異（P=0.000）。兩兩比較，ox-LDL組和拮抗組在分泌IL-6（P=0.426）和MMP-2（P=0.806）無統(tǒng)計學(xué)差異外，余組均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）。 結(jié)論： ①PLGF，作為動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性的炎性啟動因子，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細