調(diào)控干細(xì)胞能量代謝在體構(gòu)建小口徑組織工程血管.pdf

1、在過去三十年中，心腦血管疾病始終是我國(guó)城鄉(xiāng)居民的首位死因。盡管近些年來由于藥物的使用以及介入技術(shù)的發(fā)展，部分心腦血管事件的死亡率得到了控制。但是，最終越來越多的病人仍然需要進(jìn)行血管置換手術(shù)或心臟搭橋手術(shù)，這些手術(shù)都需要血管替代物。此外，血管替代物在腫瘤、外傷、炎癥引起的血管病變、動(dòng)脈瘤、動(dòng)脈夾層以及血液透析等方面也有著巨大的臨床需求。臨床上，血管替代物主要來源于自體血管或人工血管。使用自體血管移植存在以下問題:1.自體血管數(shù)量有限，疾病

2、狀態(tài)下的自體血管質(zhì)量不高;2.在取供體血管時(shí)會(huì)造成局部創(chuàng)傷，增加了手術(shù)時(shí)間以及病人的負(fù)擔(dān)。而現(xiàn)階段應(yīng)用于臨床的人工血管主要為滌綸或不可降解的高聚合物，這類人工血管不僅需要長(zhǎng)期的抗凝藥物支持，而且作為異物不能被機(jī)體吸收，彈性較差。它們僅可應(yīng)用于大口徑血管的替換。而針對(duì)小口徑（直徑＜6mm）的血管替換，還沒有可應(yīng)用于臨床的血管移植物產(chǎn)品。因此，研發(fā)新型的小口徑人工血管迫在眉睫。
　　現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)研究表明，小于6mm的人工血管長(zhǎng)期通暢率很低

3、。影響小口徑人工血管通暢率的主要因素為1.急性血栓;2.內(nèi)膜增生導(dǎo)致的管腔狹窄。血管移植物移植后直接接觸血液，作為異物很容易與血液相互作用形成血栓。因此，避免急性血栓形成是維持血管移植物早期通暢的關(guān)鍵。而內(nèi)膜增生是由各種原因引起的血管移植物內(nèi)的平滑肌異常增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積而導(dǎo)致的血管內(nèi)膜層增厚。內(nèi)膜增生是致使血管晚期堵塞的重要原因。在正常血管的表面覆蓋有內(nèi)皮層，其對(duì)防止血栓形成和維持血管的穩(wěn)態(tài)有著重要作用。對(duì)于人工血管來說，在其血

4、管內(nèi)腔內(nèi)皮化越早，血小板聚集、血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)越小。人工血管的內(nèi)皮化同樣會(huì)對(duì)后期內(nèi)膜異常增生起到抑制作用。因此促進(jìn)內(nèi)皮化是人工血管維持通暢的關(guān)鍵。
　　目前的研究發(fā)現(xiàn)，人工血管的內(nèi)皮化主要涉及以下機(jī)制，吻合口附近內(nèi)皮細(xì)胞越過吻合口向組織工程血管爬行，以及循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移歸巢至血管表面形成內(nèi)皮層。由于吻合口兩端的內(nèi)皮細(xì)胞爬行的距離很有限，因此血管移植物中段的內(nèi)皮化主要由內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移、歸巢、分化完成。在正常人體內(nèi)，內(nèi)皮祖細(xì)胞主

5、要參與血管內(nèi)衰老細(xì)胞的更換，歸巢并修復(fù)損傷部位，維持血管穩(wěn)態(tài)。內(nèi)皮祖細(xì)胞不僅能直接分化成為內(nèi)皮細(xì)胞，還可以分泌生長(zhǎng)因子促進(jìn)附近內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)以及血管再生。內(nèi)皮祖細(xì)胞的歸巢對(duì)于血管移植物的內(nèi)皮化具有重要的意義。因此，如何讓內(nèi)皮祖細(xì)胞更快的歸巢到組織工程血管表面，更快更好的發(fā)揮其功能是本研究的重點(diǎn)。
　　近些年來，關(guān)于干細(xì)胞能量代謝的研究與日俱增。研究發(fā)現(xiàn)，增加干細(xì)胞的有氧代謝水平可以有效的促進(jìn)干細(xì)胞功能的發(fā)揮。因此我們猜測(cè)，是否增強(qiáng)內(nèi)

6、皮祖細(xì)胞的代謝狀態(tài)會(huì)改善其功能，并進(jìn)一步促進(jìn)組織工程血管的內(nèi)皮化。一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)是能夠感知細(xì)胞內(nèi)能量代謝狀況的蛋白激酶。當(dāng)其感受到細(xì)胞處于能量需求狀態(tài)時(shí)會(huì)激活，從而激發(fā)其下游的信號(hào)通路，促進(jìn)分解代謝，抑制合成代謝，增加細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生。5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5-Aminoimidazole-4-carbox

7、amide1-β-D-ribofuranoside，AICAR)是一種常用的的AMPK的激動(dòng)劑，并已經(jīng)是一種被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的藥物。在此，我們使用AICAR來改善干細(xì)胞的代謝狀態(tài)，來評(píng)價(jià)其對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響，并構(gòu)建搭載AICAR納米微球的組織工程血管，建立大鼠頸動(dòng)脈移植模型，觀察其對(duì)內(nèi)皮化以及通暢率的影響。
　　此外，糖尿病在全球有著極高的發(fā)病率，而糖尿病血管病變是糖尿病并發(fā)癥中普遍存在并且嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。其血管移植術(shù)后，病

8、理狀態(tài)下參與血管移植物內(nèi)皮化的細(xì)胞的功能會(huì)減弱，血管移植物更容易發(fā)生病變以及堵塞。因此，應(yīng)用于糖尿病病人的血管移植物需要更好的生物相容性并擁有抵抗體內(nèi)病理?xiàng)l件的功能。而針對(duì)參與血管移植物再生的干細(xì)胞功能，在病理情況下會(huì)發(fā)生怎樣改變的研究也較少。我們的組織工程血管在糖尿病模型中效果如何，尚不清楚。因此，通過在高糖情況下使用AICAR刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞，改變其代謝功能，并觀察對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響，以及對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞促組織再生功能的影響。再將AI

9、CAR修飾的組織工程血管應(yīng)用于糖尿病模型，進(jìn)一步驗(yàn)證我們的假說。我們認(rèn)為基于促進(jìn)干細(xì)胞代謝的組織工程血管的研究可以為未來血管移植物的構(gòu)建提供新的思路。
　　我們對(duì)如下幾個(gè)方面進(jìn)行研究
　　1、AICAR對(duì)組織工程血管種子細(xì)胞的功能影響
　　首先，我們通過羅丹明123，線粒體染色以及細(xì)胞內(nèi)ATP的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AICAR可以明顯促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞代謝狀態(tài)。通過平板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)?zāi)M體內(nèi)血流狀態(tài)發(fā)現(xiàn)代謝功能增強(qiáng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞可以更多的歸巢

10、到血管表面。而通過Transwell和ELISA吸附試驗(yàn)(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，代謝功能增強(qiáng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移功能以及旁分泌功能同樣被增強(qiáng)了。我們認(rèn)為，通過AICAR刺激，內(nèi)皮祖細(xì)胞的代謝狀態(tài)被增強(qiáng)，并進(jìn)一步促進(jìn)了內(nèi)皮祖細(xì)胞功能。而增強(qiáng)功能的內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)工程血管的內(nèi)皮化及血管穩(wěn)態(tài)具有重要作用。
　　此外，我們還對(duì)參與組織工程血管再生的其它細(xì)胞進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示

11、AICAR可以同抑制血小板五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）和血栓素A2(ThromboxaneA2，TXA2)的分泌，維持血小板的適度聚集，促進(jìn)吻合口附近的內(nèi)皮細(xì)胞的爬行，并通過G1期聚集抑制病理性平滑肌增殖，分泌功能，促進(jìn)平滑肌能量代謝、自噬、分化以及正常的生理功能。
　　2、AICAR修飾的組織工程血管的構(gòu)建
　　為了驗(yàn)證是否AICAR可以通過增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的代謝和功能以及其它影響參與血管再生

12、的細(xì)胞功能，進(jìn)而促進(jìn)組織工程血管的內(nèi)皮化和通暢率，我們構(gòu)建了AICAR修飾的組織工程血管。通過對(duì)SD(Sprague-Dawley)大鼠頸動(dòng)脈進(jìn)行脫細(xì)胞處理后，去除其細(xì)胞成分，保留支架部分。這樣的血管支架擁有優(yōu)秀的生物相容性，以及力學(xué)強(qiáng)度。通過離子交換法制備包裹AICAR的納米微球顆粒，使AICAR具有緩釋功能。再將納米顆粒與膠原混合后與上述血管支架交聯(lián)，構(gòu)成AICAR修飾的組織工程血管。通過緩釋實(shí)驗(yàn)，力學(xué)測(cè)試和毒性檢測(cè)，驗(yàn)證組織工程血

13、管適合應(yīng)用于移植模型。接下來，通過顯微外科的技術(shù)手段，將制備好的組織工程血管移植到SD大鼠的頸動(dòng)脈中段。通過在不同時(shí)間點(diǎn)的取材切片觀察，發(fā)現(xiàn)AICAR修飾的組織工程血管通暢率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組，內(nèi)皮化和再生速度明顯加快。我們認(rèn)為AICAR可以通過促干細(xì)胞的代謝和功能，加快工程血管的內(nèi)皮化，增加血管的通暢率。
　　3、AICAR在高糖狀態(tài)下改善內(nèi)皮祖細(xì)胞能量代謝及功能。
　　進(jìn)一步我們?cè)诟咛乔闆r下對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并做功能檢測(cè)。

14、通過羅丹明123，線粒體染色，細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)以及更為精確的細(xì)胞耗氧量檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)AICAR可以明顯改善高糖狀態(tài)下較差的內(nèi)皮祖細(xì)胞代謝狀態(tài)，逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞代謝功能的損傷。AICAR還可以改善組細(xì)胞增加高清情況下內(nèi)皮祖細(xì)胞的葡萄糖吸收，增加能量攝取，并減少局部的糖濃度。在自噬檢測(cè)中我們也發(fā)現(xiàn)AICAR可以促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的自噬產(chǎn)生。這對(duì)于高糖情況下，維持高糖損傷后的內(nèi)皮祖細(xì)胞穩(wěn)

15、態(tài)具有重要的意義。而通過ELISA，Transwell實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了，受損的內(nèi)皮祖細(xì)胞的旁分泌，遷移功能在AICAR處理后得到了恢復(fù)和增強(qiáng)。上述結(jié)果說明，AICAR可以逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)于內(nèi)皮祖細(xì)胞的代謝和功能損害，而恢復(fù)的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能會(huì)對(duì)糖尿病組織工程血管的內(nèi)皮化起到促進(jìn)作用。
　　4、AICAR修飾的組織工程血管在糖尿病模型中的應(yīng)用
　　內(nèi)皮祖細(xì)胞在糖尿病大血管病變以及微血管病的形成、修復(fù)中都有重要的作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證增強(qiáng)代謝

16、對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)功能的作用，我們?cè)谔悄虿⌒∈笕毖韵轮珴兡Ｐ椭羞M(jìn)行了在體實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)AICAR預(yù)處理后的內(nèi)皮祖細(xì)胞或糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞均比未處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞在糖尿病潰瘍組織中有著更好的細(xì)胞存活率，微血管生成和組織修復(fù)率。而AICAR預(yù)處理的AMPKa2-/-小鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞相比于C57BL/6J小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞，則有著更低的細(xì)胞存活率，微血管生成和組織修復(fù)率。因此我們認(rèn)為AICAR可以通過AMPK通路，改善內(nèi)皮祖細(xì)胞在糖尿病病患體內(nèi)的存

17、活率以及血管再生功能。進(jìn)一步，我們構(gòu)建了糖尿病大鼠頸動(dòng)脈移植模型。通過3個(gè)月的觀察，AICAR修飾的組織工程血管仍然具有較高的通暢率。而研究證明一些應(yīng)用于非糖尿病模型中具有高通暢率的組織工程血管，在糖尿病模型移植術(shù)后的通暢率卻不盡如人意。此外，我們還發(fā)現(xiàn)相比與非糖尿病模型，糖尿病模型中組織工程血管的細(xì)胞化的速度明顯減慢。
　　綜上所述，本論文通過多個(gè)動(dòng)物模型的構(gòu)建以及體外實(shí)驗(yàn)證明，通過模式分子AICAR的刺激增強(qiáng)或改善的內(nèi)皮祖細(xì)胞