新型組織工程人工小口徑血管的構(gòu)建及抗凝性能研究.pdf

1、目的：應(yīng)用組織工程方法構(gòu)建可降解性小口徑人工血管支架，對其進(jìn)行生物力學(xué)研究和體內(nèi)降解實驗；分離和培養(yǎng)犬骨髓CD34+細(xì)胞，研究其生物學(xué)特性并種植于小口徑人工血管支架內(nèi)表面；對小口徑人工血管的內(nèi)皮化和抗凝性能進(jìn)行研究，以篩選更理想的細(xì)胞源。
　　 方法:
　　 ①篩選出具有抗張強(qiáng)度高、力學(xué)性能優(yōu)良的聚對二氧環(huán)己酮(PDS)可吸收縫線進(jìn)行編織，測定和分析PDS縫合線的生物力學(xué)性能，并通過對不同的編織工藝加以研究、比較，選擇最

2、為合適的編織方法和工藝編織血管支架。
　　 ②以可降解的PDS縫合線編織成的網(wǎng)管狀織物作為血管支架，模仿天然血管的三層結(jié)構(gòu)，內(nèi)層涂以共混硫酸軟骨素－膠原海綿，外層包被小腸黏膜下層(SIS)，檢測血管支架的生物力學(xué)性能(爆破壓力、抗拉伸能力、順應(yīng)性等)，并與正常生理血管進(jìn)行比較。將支架材料植入比格犬背部脊柱兩側(cè)肌肉內(nèi)，于2、4、8、12、24周取出，行組織學(xué)和透視電鏡觀察，觀察其組織反應(yīng)及降解情況。
　　 ③抽取犬骨髓，F(xiàn)

3、icoll液分離單個核細(xì)胞(MNCs)，免疫磁珠分離CD34+細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞純度，DMEM液培養(yǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)誘導(dǎo)分化，行CD31、vWF(Ⅷ因子)免疫熒光、免疫組織化學(xué)、Dil-Ac-LDL吸收實驗、體外成血管實驗鑒定細(xì)胞特性和功能。
　　 ④將誘導(dǎo)的MNCs和CD34+細(xì)胞種植于人工小血管支架內(nèi)表面，人工小血管置換一段犬頸動脈，構(gòu)建動物模型。掃描電鏡觀察細(xì)胞在人工血管腔面的分布和生長情況。行體內(nèi)外血

4、小板粘附實驗和血栓形成實驗比較兩種常用種子細(xì)胞抗凝性能的差異。
　　 結(jié)果:
　　 ①聚對二氧環(huán)己酮單絲強(qiáng)度高，斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率兩個指標(biāo)PDS均大于直徑相同的聚丙烯纖維。PDS纖維柔順性好，編織性能好，采用規(guī)則編織結(jié)構(gòu)可編織出強(qiáng)度高彈性好、孔隙率大、光滑平整的網(wǎng)狀血管支架。
　　 ②所制備的復(fù)合型人工血管的爆破壓為(43.5±8.3)kPa，斷裂強(qiáng)度為(19.10±1.56)N，應(yīng)變率為(42.88±3.16

5、)％，徑向順應(yīng)性為(5.96±0.87)％/100mmHg。
　　 ③植入體內(nèi)2-4周時，SIS與膠原層清晰可見，炎細(xì)胞浸潤較多，掃描電鏡見膠原海綿網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)破壞融合，形成板層結(jié)構(gòu)，海綿結(jié)構(gòu)基本保持。12周時，自身纖維結(jié)締組織完全取代膠原蛋白海綿材料，纖維組織廣泛長入網(wǎng)材孔間隙內(nèi)，炎性細(xì)胞減少，PDS發(fā)生了部分降解。24周時，支架材料完全吸收，被新生纖維組織填充，炎細(xì)胞和和異物巨噬細(xì)胞少見。降解過程中未見材料周圍組織變性、壞死或肉

6、芽腫異常增生現(xiàn)象。
　　 ④經(jīng)流式細(xì)胞儀測定，免疫磁珠方法分離的細(xì)胞中CD34+細(xì)胞含量為78.46±6.37％。經(jīng)免疫磁珠分離獲得的骨髓CD34+細(xì)胞在倒置顯微鏡下為折光性強(qiáng)的圓形細(xì)胞，大小均一，24h后觀察開始出現(xiàn)貼壁細(xì)胞，呈圓形，隨后逐漸伸出偽足，倒置顯微鏡下剛貼壁的細(xì)胞呈典型的“鵝卵石”狀，細(xì)胞形態(tài)逐漸演變成梭型，兩周后細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)瓶底面。
　　 ⑤免疫熒光、免疫組織化學(xué)結(jié)果示CD31和vWF表達(dá)均為陽性，D

7、il-Ac-LDL吸收功能實驗陽性，體外成血管實驗陽性，證明CD34+被成功誘導(dǎo)向內(nèi)皮細(xì)胞分化。
　　 ⑥掃描電鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞在人工血管內(nèi)表面的種植情況，可見大量內(nèi)皮細(xì)胞粘附于人工血管內(nèi)表面，細(xì)胞形態(tài)伸展，連續(xù)性較好，有偽足伸出并長入血管內(nèi)表面微孔內(nèi)。
　　 ⑦體內(nèi)外血小板聚集實驗可見MNCs細(xì)胞組血小板粘附數(shù)量明顯多于CD34+細(xì)胞組，說明CD34+細(xì)胞誘導(dǎo)后具有抗血小板粘附聚集的能力。大體標(biāo)本HE染色同樣顯示CD34

8、+細(xì)胞誘導(dǎo)后具有較強(qiáng)的抗血栓形成的能力。
　　 結(jié)論:
　　 ①聚對二氧環(huán)己酮力學(xué)性能優(yōu)良，可作為可降解性小血管支架的編織材料。采用65度編織工藝角和規(guī)則編織結(jié)構(gòu)的編織工藝，可制備出力學(xué)性能良好，彈性回復(fù)率佳的小口徑網(wǎng)管作為組織工程血管支架。
　　 ②所制備的復(fù)合型小口徑人工血管支架的生物力學(xué)性能良好，能滿足體內(nèi)植入的要求。
　　 ③所制備的復(fù)合型小口徑人工血管支架生物相容性好，組織反應(yīng)輕，降解時間合適。