SNAP-25通過調(diào)控Glu神經(jīng)遞質(zhì)在B[a]P致神經(jīng)毒作用機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分：亞慢性B[a]P暴露對SD大鼠海馬中SNAP-25及GluR的影響
　　目的：
　　通過建立苯并[a]芘（Benzo(a)pyrene,B[a]P）所誘導(dǎo)的動物神經(jīng)毒性模型，觀察其對SD大鼠海馬組織中谷氨酸（glutamate,Glu）含量的改變及對突觸小體相關(guān)蛋白（Synaptosome-associated proteinof25 kDa,SNAP-25）、谷氨酸受體（glutamate receptor,Gl

2、uR）表達(dá)的影響，為揭示SNAP-25及Glu在B[a]P所致神經(jīng)毒性中所扮演的重要作用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　80只雄性SD幼鼠，日齡5天，隨機(jī)分為溶劑對照組、B[a]P低劑量組（0.02 mg/kg）、B[a]P中劑量組（0.2 mg/kg）和B[a]P高劑量組（2.0 mg/kg），按分組及其體質(zhì)量連續(xù)灌胃處理7周，溶劑對照組給以等量花生油處理。染毒結(jié)束后采用Morris水迷宮檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；采用1H-磁

3、共振波譜法（1H-MRS）檢測Glu在相關(guān)腦區(qū)的代謝參數(shù)；電鏡觀察海馬組織神經(jīng)元、突觸及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等變化。分別于染毒1周及7周末，分離海馬組織，并采用免疫組化法及Western-blot測定海馬組織中SNAP-25及谷氨酸受體（glutamate receptor,GluR）的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　?。?）當(dāng)B[a]P處理35天后，B[a]P處理組老鼠體重較對照組明顯下降，尤以0.2和2.0 mg/kg組下降明顯，差異

4、具有統(tǒng)計學(xué)意義[F(3,76)=3.881,P=0.008]；
　?。?）Morris水迷宮顯示，B[a]P處理組較溶劑對照組逃避潛伏期及游泳距離增加，而跨平臺次數(shù)及在目標(biāo)象限停留時間顯著減少；
　?。?）電鏡結(jié)果示，B[a]P暴露組較溶劑對照組海馬組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞漿腫脹、擴(kuò)大，形態(tài)不規(guī)則，海馬組織中突觸間隙明顯增寬；
　?。?）1H-MRS結(jié)果顯示，與對照組（0.996±0.236 ppm）相比，隨著染毒濃度的增加，海

5、馬中Glu的含量呈下降趨勢（各染毒組分別為0.722±0.185,0.687±0.172和0.583±0.154 ppm）；
　?。?）與溶劑對照組相比，B[a]P暴露1周及7周后，海馬組織中GluR1及GluR2表達(dá)均明顯降低，而SNAP-25表達(dá)增加。
　　結(jié)論：
　　B[a]P亞慢性暴露可引起新生幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力缺陷，改變海馬組織的超微結(jié)構(gòu)，其可能的神經(jīng)毒作用機(jī)制在于通過降低Glu水平而改變Glu的傳輸，降低Gl

6、uR的表達(dá)，增強(qiáng)SNAP-25的表達(dá)。
　　第二部分：SNAP-25及GluR在B[a]P誘導(dǎo)神經(jīng)毒作用機(jī)制的研究
　　目的：
　　探討B(tài)[a]P對U87細(xì)胞活性及凋亡的影響，并通過觀察改變SNAP-25蛋白的表達(dá)后其對GluR表達(dá)的影響。
　　方法：
　　采用MTT法觀察B[a]P對U87細(xì)胞活性的影響；并通過AO-EB染色法、Hoechst33258染色法及annexinV-FITC/PI雙染法進(jìn)一步觀

7、察B[a]P對U87細(xì)胞的凋亡情況；B[a]P染毒后，采用Fluo-3 AM熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i含量；通過siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)抑制SNAP-25蛋白的表達(dá)后，采用Western-blot及RT-PCR進(jìn)一步觀察其對GluR的影響。
　　結(jié)果：
　?。?）B[a]P染毒24 h后，U87細(xì)胞的細(xì)胞活性明顯降低，呈明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系；
　?。?）AO-EB染色法、annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示

8、B[a]P暴露組較對照組細(xì)胞凋亡率明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Hoechst33258染色法顯示，B[a]P暴露組部分細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)濃集，致密濃染，呈強(qiáng)藍(lán)色熒光；
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)示，U87細(xì)胞各細(xì)胞周期比例（G0/G1:56.04%±2.78%；G2/M:12.44%±2.71%；S:9.05%±0.79%）較對照組（G0/G1:56.44%±2.44%；G2/M:11.79%±3.66%；S:8.57