乙型病毒性肝炎及相關(guān)疾病蛋白質(zhì)組學(xué)及臨床診斷的研究.pdf

1、乙型病毒性肝炎世界范圍內(nèi)流行，是已知各型肝炎中危害最嚴(yán)重的一種。目前全世界范圍內(nèi)約有3.5億慢性乙肝感染者，其中15％-25％將發(fā)展并最終死于相關(guān)的肝損傷、肝硬化和肝細(xì)胞癌，嚴(yán)重威脅人們的健康。本課題研究目的即在于嘗試采用高效數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法，提高檢測(cè)數(shù)據(jù)的利用率。同時(shí)利用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)積極探索尋找新的生物標(biāo)志物，為臨床診斷和治療乙肝及相關(guān)疾病提供幫助。第一部分決策樹模型在乙型病毒性肝炎及相關(guān)疾病診斷中的應(yīng)用
　　 目的：用決策樹

2、模型對(duì)臨床常用檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次發(fā)掘利用，是一種有效的降維數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法。由于乙型肝炎及相關(guān)疾病如肝硬化、肝癌等病情復(fù)雜多變、病程長(zhǎng)，因此在臨床上將會(huì)產(chǎn)生大量、多維的檢測(cè)數(shù)據(jù)。盡管在這些數(shù)據(jù)中蘊(yùn)含了豐富的疾病信息，但臨床醫(yī)生往往孤立地看待每一個(gè)檢測(cè)結(jié)果，很難把它們綜合利用及分析，更談不上對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行深加工利用，其結(jié)果就是疾病信息的丟失和浪費(fèi)，并最終導(dǎo)致臨床診斷的不準(zhǔn)確、治療的不及時(shí)和沒有針對(duì)性、直至延誤病情。本部分將以慢性乙肝與肝硬化及肝

3、癌鑒別比較、慢性乙肝輕、中、重不同型別的鑒別比較為例，用決策樹模型的方法將臨床常用數(shù)據(jù)進(jìn)行再挖掘，為臨床決策提供參考。
　　 方法：目前構(gòu)建決策樹模型主要有四種算法，即CRT（分類與回歸樹）、QUEST（快速無偏高效統(tǒng)計(jì)樹）、CHAID（卡方自動(dòng)交互探測(cè)）和EXHAUSTIVE CHAID（窮舉CHILD）。前兩種算法為一類，構(gòu)建的樹模型稱二叉樹；后兩種算法為一類，構(gòu)建的樹模型稱多叉樹。研究中，在兩類算法中各選擇一種算法作為代表

4、，即CHAID和CRT，對(duì)慢性乙肝與肝硬化及肝癌，慢性乙肝輕、中、重不同型別分類構(gòu)建決策樹模型并進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)和準(zhǔn)確度評(píng)估。同時(shí)以慢性乙肝分型為例用主成分分析方法加以驗(yàn)證，考察模型的實(shí)用性。
　　 結(jié)果：利用CHAID和CRT兩種算法用于慢性乙肝輕型和中重型分類診斷時(shí)，所構(gòu)建的兩個(gè)模型的正確分類率分別達(dá)到77.5％和78.4％，模型的擬合效果良好，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果均為0.353，在可接受范圍內(nèi)。ROC（受試者工作特征）曲線下面積分別為0.

5、787（CI95％：0.695-0.879）和0.802（CI95％：0.714-0.890），準(zhǔn)確度評(píng)估良好；而利用CHAID和CRT兩種算法用于慢性乙型肝炎與肝硬化及肝癌分類診斷時(shí)，所構(gòu)建的兩個(gè)模型的正確分類率分別達(dá)到71.4％和74.2％，模型的擬合效果良好，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果分別為0.451和0.352，雖在可接受范圍內(nèi)，但CHAID模型風(fēng)險(xiǎn)稍高。ROC曲線下面積分別為0.785（CI95％：0.692-0.878）和0.807（CI

6、95％：0.720-0.894），準(zhǔn)確度評(píng)估良好。
　　 結(jié)論：決策樹模型在對(duì)臨床常見數(shù)據(jù)的挖掘再利用方面具有一定價(jià)值，可以大大提高診斷的準(zhǔn)確度，為臨床醫(yī)生決策提供幫助。而且此結(jié)論已經(jīng)得到主成分分析的驗(yàn)證，兩者有極好的吻合，較為可信。在進(jìn)行慢性乙肝中重型診斷時(shí)，應(yīng)優(yōu)先考慮ALT、AST和乙肝病毒載量等指標(biāo)；而試圖從慢性乙肝患者中篩檢肝硬化或肝癌時(shí)，年齡、職業(yè)和膽紅素指標(biāo)更為重要。肝纖四項(xiàng)（HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C）未進(jìn)入決策樹

7、模型，表明該四項(xiàng)指標(biāo)對(duì)判定肝纖維化程度價(jià)值不大。
　　 第二部分基于磁珠樣品制備和基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
　　 目的：利用基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）技術(shù)檢測(cè)樣本血清蛋白或多肽，考察實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性及血清不同的凍融次數(shù)和基質(zhì)與樣品搭配比例對(duì)結(jié)果的影響。以便摸索一套有效的血清樣品收集、處理、存儲(chǔ)和實(shí)驗(yàn)方法。同時(shí)比較分析兩種磁珠的優(yōu)劣，為后續(xù)大規(guī)模檢測(cè)研究提供科學(xué)的選擇

8、依據(jù)。
　　 方法：首先采用IMAC-Cu磁珠進(jìn)行樣本蛋白分離提純，經(jīng)MALDI-TOF MS檢測(cè)后，選擇不同分子量范圍內(nèi)9個(gè)蛋白重復(fù)測(cè)定，比較組間和組內(nèi)變異系數(shù)以考察重復(fù)性及實(shí)驗(yàn)室條件的影響；比較不同條件下蛋白質(zhì)譜圖來判斷凍融次數(shù)和基質(zhì)與樣品搭配比例對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。然后比較WCX和IMAC-Cu兩種磁珠的平均出峰量、平均峰面積和平均峰強(qiáng)度等參數(shù)，擇優(yōu)為后續(xù)研究做準(zhǔn)備。研究過程中儀器操作、數(shù)據(jù)分析和圖像采集分別用flexCon

9、trolMS3.0、ClinProToolsTM2.1和flexAnalysis3.0軟件。
　　 結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)，樣品與基質(zhì)的適宜比例為1：5（ul），并且實(shí)驗(yàn)室溫度控制在20℃～25℃，濕度在10％～30％時(shí)點(diǎn)樣結(jié)晶效果最佳。樣品的凍融最好不要超過3次，否則對(duì)質(zhì)譜出峰有影響。凍融次數(shù)越多，對(duì)小分子量蛋白或多肽的影響比大分子量蛋白或多肽影響大。反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性的變異系數(shù)為1.26％～30.79％，在可接受范圍內(nèi)。相同樣本利用

10、WCX磁珠處理后的平均出峰量和平均峰面積均明顯優(yōu)于IMAC-Cu磁珠。
　　 結(jié)論：MALDI-FOF MS作為一種高靈敏度的研究平臺(tái)，嚴(yán)格操作程序可以減少變異，提高結(jié)果的重復(fù)性和可信性。WCX磁珠的蛋白分離效果優(yōu)于IMAC-Cu磁珠，選擇用于后續(xù)大規(guī)模檢測(cè)。
　　 第三部分乙型肝炎及相關(guān)疾病血清蛋白質(zhì)組的比較分析
　　 目的：檢測(cè)急性乙肝（AHB）、慢性乙肝（CHB）、肝硬化（LC）和原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）患

11、者血清蛋白質(zhì)譜圖，比較組間差異，尋找差異蛋白并評(píng)估其分類價(jià)值，為臨床診斷應(yīng)用提供參考。
　　 方法：首先按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，收集14例AHB、76例CHB、41例LC和14例HCC患者的血清樣本，用WCX磁珠進(jìn)行樣本前處理，然后用MALDI-TOF MS檢測(cè)不同組患者蛋白質(zhì)譜圖并加以對(duì)比分析。研究過程中儀器操作、數(shù)據(jù)分析和圖像采集分別用flexControlMS3.0、ClinProToolsTM2.1和flexAnalysis3

12、.0軟件。對(duì)所發(fā)現(xiàn)的差異蛋白分別計(jì)算分類的靈敏度、特異度和驗(yàn)證正確率，或差異蛋白組合后診斷的效果，以指導(dǎo)臨床應(yīng)用。此外追蹤觀察4例AHB患者血清蛋白質(zhì)譜圖變化，尋找判斷急性乙肝轉(zhuǎn)慢的生物標(biāo)志物。
　　 結(jié)果：AHB和CHB患者血清蛋白質(zhì)組比較，在所發(fā)現(xiàn)的49個(gè)差異蛋白中，僅4154Da和4210Da分類效果相對(duì)較優(yōu)，聯(lián)合作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于診斷AHB的靈敏度、特異度、驗(yàn)證正確率分別達(dá)到100％（14/14）、84.21％（64/

13、76）和86.67％（78/90）。對(duì)4例AHB患者追蹤觀察發(fā)現(xiàn)，血清2952Da、4210Da、5337Da和5904Da蛋白表達(dá)量因不同轉(zhuǎn)歸而表現(xiàn)迥異。CHB輕、中、重型血清蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)，輕型和中型無差異而合并為一組，然后與CHB重型比較。差異蛋白中1866Da蛋白表現(xiàn)最優(yōu)，單獨(dú)用來區(qū)分慢性重型乙肝的靈敏度和特異度達(dá)到100％和88.89％，驗(yàn)證正確率為93.42％，是一個(gè)良好的生物標(biāo)志物，值得進(jìn)一步研究。CHB患者和HCC患者

14、血清蛋白質(zhì)組的對(duì)比，11243Da和4210Da兩個(gè)蛋白分類效果相對(duì)較好，聯(lián)合應(yīng)用診斷HCC的靈敏度、特異度和驗(yàn)證正確率分別達(dá)到92.86％（13/14）、77.63％（59/76）和80％（72/90）。HCC和LC患者血清蛋白質(zhì)組差異不大，僅一個(gè)差異蛋白。
　　 結(jié)論：AHB和CHB患者血清蛋白質(zhì)組存在明顯差異，其中4154Da和4210Da兩個(gè)蛋白組合使用可以有效鑒別AHB，應(yīng)當(dāng)成為今后分類診斷的候選蛋白。AHB患者因不同

15、轉(zhuǎn)歸而表現(xiàn)迥異的蛋白2952Da、4210Da、5337Da和5904Da是今后進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。CHB輕、中、重型血清蛋白質(zhì)組比較發(fā)現(xiàn)，1866Da蛋白表現(xiàn)最優(yōu)，完全可以作為獨(dú)立的生物標(biāo)志物用來鑒別診斷CHB重型。血清11243Da和4210Da蛋白組合應(yīng)用從CHB患者中間篩選HCC具有實(shí)際價(jià)值，而從LC患者中間篩選HCC患者意義不大。在所發(fā)現(xiàn)的差異蛋白中，1866Da和4210Da蛋白最為重要，需要下一步鑒定。
　　 第四部

16、分差異蛋白質(zhì)的鑒定
　　 目的：對(duì)所發(fā)現(xiàn)的1866Da和4210Da蛋白進(jìn)行鑒定，并初步推測(cè)其在乙肝病毒感染過程中的作用機(jī)制。
　　 方法：采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索比對(duì)從而定性。其中4210Da蛋白鑒定使用數(shù)據(jù)分析軟件BioworksBrowser3.3.1 SP1進(jìn)行SequestTM檢索，檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為IPI Human（3.45）；1866Da蛋白使用數(shù)據(jù)分析

17、軟件DataAnalysis3.4.（Bruker Daltonics）進(jìn)行MS/MS檢索，檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為Mascot database。
　　 結(jié)果：采用LC-MS/MS方法檢測(cè)1866Da和4210Da蛋白，并通過網(wǎng)絡(luò)查詢和同源性比較發(fā)現(xiàn)，1866Da蛋白被鑒定為DRC3f，為補(bǔ)體C3f脫精氨酸而成，而補(bǔ)體C3是補(bǔ)體系統(tǒng)中的主要成分，其血清含量可以反映人體的免疫狀況；4210Da蛋白被鑒定為“GSPT2，真核肽鏈釋放因子GTP

18、結(jié)合亞單位（eRF）”，即eRF3b裂解后的一部分-36肽。GSPT2編碼eRF3b，具有參與蛋白合成中止的功能。
　　 結(jié)論：1866Da蛋白鑒定為DRC3f，是補(bǔ)體C3的衍生物。4210Da蛋白鑒定為eRF3b裂解后的一部分-36肽。由于補(bǔ)體系統(tǒng)參與人體免疫調(diào)節(jié)、eRF3b參與調(diào)控蛋白合成。因此，C3f和/或DRC3f以及eRF3b的裂解物的出現(xiàn)可能反映了肝臟感染乙肝病毒后炎癥反應(yīng)的某種機(jī)制，其表達(dá)量的變化很可能與肝臟的炎癥