糖皮質激素反常促進人羊膜成纖維細胞中前列腺素合成關鍵酶-2基因表達的分子機制.pdf

1、流行病學調查發(fā)現,早產兒成年后可能易患心血管疾病、糖尿病和肥胖等。因此,防治早產是優(yōu)生優(yōu)育的重要一環(huán),但目前尚缺乏防治和預測早產的有效手段,其主要原因是人類分娩啟動的機制尚未解析。因此,解析人類分娩啟動機制、優(yōu)生優(yōu)育已經成為國際生殖生物學領域的研究熱點之一。糖皮質激素是經典的抗炎激素,可以誘導抗炎因子的合成并抑制炎癥介質如前列腺素(PG)的合成,但大量實驗表明,糖皮質激素對人羊膜前列腺素的合成具有反常的促進作用,由于PG在分娩時可促進子

2、宮平滑肌收縮即能誘發(fā)宮縮、促進宮頸成熟及促進胎膜破裂,所以其在分娩發(fā)動中起主導作用。因此糖皮質激素反常促進人羊膜PG合成的作用可能是分娩發(fā)動的重要機制之一。現已明確,糖皮質激素的反常促進羊膜前列腺素合成的作用是通過誘導羊膜成纖維細胞胞漿型磷脂酶A2(cPLA2)和前列腺素H合酶-2(PGHS-2)即環(huán)氧合酶-2(COX-2)表達來實現的,但其分子機制尚未闡明。本課題克隆了人羊膜成纖維細胞COX-2基因的啟動子,在此基礎上研究了糖皮質激素

3、反常促進人羊膜成纖維細胞COX-2基因表達的分子機制,以初步解析糖皮質激素反常促進人羊膜成纖維細胞PG合成的分子機制。
　　 研究內容:
　　 首先通過實時定量PCR從COX-2 mRNA水平驗證糖皮質激素(GC)對人羊膜成纖維細胞COX-2表達的反常促進作用,同時研究糖皮質激素對COX-2表達反常促進作用的特點,即是否受糖皮質激素受體介導、其作用是否通過刺激轉錄過程實現的。其次,如果糖皮質激素對人羊膜成纖維細胞COX-

4、2表達確有反常促進作用,而且此作用依賴于轉錄過程,我們則對人羊膜成纖維細胞COX-2基因啟動子進行克隆及構建報告基因重組質粒并做進一步的細胞轉染實驗,以確定糖皮質激素是否對COX-2基因啟動子具有直接作用以及糖皮質激素對COX-2基因啟動子反常促進作用的特點;如果糖皮質激素確實對COX-2基因啟動子具有直接作用,那么我們需要進一步確定COX-2基因啟動子上介導糖皮質激素作用的順式作用元件。為了驗證糖皮質激素對人羊膜成纖維細胞COX-2表

5、達的反常促進作用的特異性,我們同時也在人胎兒肺成纖維細胞株(HFL-1)中做了比較對照實驗,以確認糖皮質激素反常促進人羊膜成纖維細胞COX-2表達的可靠性。
　　 主要研究方法:
　　 1、取樣、收集、培養(yǎng)人足月擇期剖宮產羊膜成纖維細胞,抽提人羊膜成纖維細胞mRNA、逆轉錄并做熒光實時定量PCR檢測糖皮質激素(皮質醇)對COX-2 mRNA水平的影響,并與HFL-1細胞進行比較。
　　 2、克隆人羊膜成纖維細胞C

6、OX-2基因啟動子,構建COX-2基因啟動子熒光素酶報告基因重組質粒,并轉染人羊膜成纖維細胞和HFL-1細胞,研究在這兩種細胞中糖皮質激素(皮質醇)對COX-2基因啟動子活性影響的異同。
　　 3、構建不同5'未端長度的COX-2啟動子報告基因質粒并轉染人羊膜成纖維細胞細胞及HFL-1細胞以找出糖皮質激素(皮質醇)對COX-2基因啟動子的大致調節(jié)位點,在此基礎上對可能位點進行定點突變,以確認介導皮質醇作用的順式反應元件。

7、　　 4.在上述實驗的基礎上,用染色質免疫沉淀(ChIP)的方法,研究所推斷的轉錄因子是否可以與所識別的介導皮質醇作用的順式反應元件相結合。
　　 主要研究結果:
　　 1.皮質醇對人羊膜成纖維細胞COX-2 mRNA表達確有反常促進作用,而在人胎兒肺細胞株中糖皮質激素對COX-2 mRNA的表達則是經典的抑制作用,而且皮質醇對人羊膜成纖維細胞COX-2表達的反常促進作用可以被糖皮質激素受體拮抗劑RU486和mRNA轉

8、錄抑制劑DRB所阻斷,說明此反常促進是由GR受體介導的轉錄促進過程。
　　 2.從培養(yǎng)的人羊膜成纖維細胞中成功克隆了COX-2基因啟動子-886bp～+33bp片段,經測序,該序列與Genbank中所報道序列相同。將克隆的COX-2基因啟動子與含報告基因的質粒進行重組和擴增,并用其轉染人羊膜成纖維細胞和HFL-1細胞,發(fā)現皮質醇在人羊膜成纖維細胞細胞中對COX-2基因啟動子活性具有劑量依賴性促進作用,而且可以被RU486所阻斷,

9、而在HFL細胞中皮質醇對COX-2啟動子活性則是經典的劑量依賴性抑制作用,而且也可以被RU486所阻斷,另外,皮質醇還可以阻斷白細胞介素-1β對COX-2基因啟動子的誘導作用。
　　 3.我們進一步采用了由5'末端向3'末端逐漸刪除COX-2基因啟動子的方法,研究了介導皮質醇對人羊膜成纖維細胞和HFL-1細胞COX-2基因啟動子作用的反應元件。研究發(fā)現介導皮質醇對人羊膜成纖維細胞COX-2表達的反常促進作用的啟動子序列位于-66

10、bp下游,而介導皮質醇對HFL-1細胞COX-2表達的經典抑制作用的啟動子序列位于-453bp～-340bp之問。進一步對上述片段所存在的轉錄因子結合位點進行生物信息學分析,并對可能的轉錄因子結合位點堿基進行定點突變,發(fā)現介導皮質醇反常促進人羊膜成纖維細胞COX-2基因表達的順式反應元件是位于-59bp～-53bp處的cAMP反應元件(CRE),而介導皮質醇對HFL-1細胞COX-2基因表達抑制作用的順式反應元件是位于-448bp～-4

11、39bp處的NFκB結合位點。
　　 4.ChIP研究發(fā)現,在皮質醇刺激人羊膜成纖維細胞后,CRE結合蛋白(CREB)與COX-2基因啟動子含CRE位點的DNA片段結合增加。表明CREB蛋白可能是參與人羊膜成纖維細胞中皮質醇反常促進COX-2表達的轉錄因子。
　　 結論:皮質醇通過COX-2基因啟動子的CRE反常促進人羊膜成纖維細胞COX-2的表達,而在HFL-1細胞皮質醇通過COX-2基因啟動子的NFκB結合位點對CO