自噬參與DEHP誘導新生鼠原始卵泡的異常發(fā)育.pdf

1、目的：鄰苯二甲酸二乙基己酯（diethylhexyl phthalate，DEHP）是一種聚氯乙烯材料增塑劑，因其與塑料基質之間不形成共價鍵，而是以氫鍵和范德華力連接，故易從塑料中溶出而污染環(huán)境，對人類的健康造成影響。已有相關文獻報導，DEHP是一種環(huán)境類雌激素，一旦進入人體，可對人類身體健康造成多方面的影響。DEHP對女性生殖健康的影響已得到廣泛的關注。現(xiàn)有研究表明，卵巢是 DEHP雌性毒性作用的主要靶器官。課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，DEH

2、P可以誘導新生鼠原始卵泡的發(fā)育出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，但其作用機制是如何產(chǎn)生的，并不清楚。自噬是真核細胞中普遍存在的生命現(xiàn)象，是將細胞內變形、衰老或損傷的蛋白質和細胞器轉運到溶酶體腔中消化降解的一種代謝過程，在維持細胞存活、更新、物質再利用和內環(huán)境穩(wěn)定中起著重要作用。因此，本文旨在研究自噬是否參與 DEHP誘導新生鼠原始卵泡發(fā)育異常這一過程。
　　方法：將健康6~8周齡清潔級成年雌性昆明鼠隨機分為對照組和DEHP組，每組30只。待成年雌鼠生

3、產(chǎn)后，采用腹腔注射方式，DEHP組按濃度×體重（g）/天（d），即0.62mg/kg/d、2.5mg/kg/d、5 mg/kg/d、10 mg/kg/d劑量對新生鼠進行腹腔注射,對照組注射相同體積玉米油，從新生鼠出生后第1天（1 day post-parturition，1 dpp）開始注射，每天1次，連續(xù)5天，注射結束后，第6天早上（6 dpp）收集新生鼠卵巢組織，進行以下實驗：①研究DEHP對卵泡發(fā)育的影響：HE染色觀察新生鼠卵巢卵

4、泡的發(fā)育情況；透射電鏡觀察 DEHP對新生鼠卵巢卵泡的影響；Real-time PCR檢測卵泡發(fā)育標志分子即生長分化因子9（Growth Differentiation Factor9,GDF9）mRNA的變化情況。②研究DEHP對新生鼠卵巢自噬形成過程中標志物的影響：Western blot檢測自噬小體標志性蛋白LC3的表達情況；透射電鏡檢測自噬小體。③研究 DEHP對新生鼠卵巢自噬形成過程中關鍵蛋白的影響：Real-time PCR

5、檢測ULK1、Beclin1、Atg5的mRNA表達情況；Western blot檢測p-ULK1、Beclin1、Atg5的蛋白表達水平。④研究DEHP對新生鼠卵巢自噬形成的影響：Western blot檢測AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、p-P70s6k（T389）、p-4EBP1的蛋白表達情況；⑤研究DEHP對自噬降解的影響：Real-time PCR檢測 LAMP2、P62、Cathepsin B的mRNA表達情

6、況； Western blot檢測 LAMP2、P62、Cathepsin B、Cathepsin L的蛋白表達情況。⑥研究DEHP聯(lián)合自噬抑制劑3-MA干預后對新生鼠卵泡發(fā)育的影響：HE染色觀察卵泡發(fā)育情況，并對卵巢中的原始卵泡進行計數(shù)。
　　結果：采用DEHP處理新生鼠之后，結果顯示：?、HE染色結果顯示，與對照組比較，DEHP處理組新生鼠，原始卵泡數(shù)量明顯減少，且 DEHP濃度越高，原始卵泡數(shù)量減少得越明顯。?、透射電鏡下觀

7、察到采用 DEHP處理之后，卵細胞減小，透明帶絨毛膜不明顯，卵泡細胞數(shù)量減少，卵細胞發(fā)育遲緩。且采用低劑量0.62mg/kg濃度處理新生鼠之后，可在新生鼠卵巢組織中發(fā)現(xiàn)大量自噬小體的存在。?、Western blot結果顯示，與對照組相比，DEHP處理組自噬標志性分子LC3蛋白的表達顯著增加，與自噬形成過程相關的蛋白Atg5、Beclin1、p-P70s6k（T389）、p-AMPK、p-mTOR的表達亦明顯增加；p-ULK1、p-4E

8、BP1表達明顯降低；同時與自噬降解關系密切的蛋白 LAMP2、Cathepsin L、Cathepsin B、P62表達亦顯著增加。Real-time PCR結果顯示Atg5、Beclin1、LAMP2、Cathepsin B、P62、ULK1的mRNA表達結果與蛋白表達結果一致。④、HE染色結果顯示DEHP聯(lián)合自噬抑制劑3-MA處理后其原始卵泡數(shù)量明顯增加。
　　結論：在 DEHP的作用下，新生鼠卵巢中的自噬小體增加，自噬形成過