載辛伐他汀PLGA微球-磷酸鈣組織工程骨的生物相容性和成骨活性的研究.pdf

1、目的:
　　本實(shí)驗(yàn)采用水包油包固態(tài)物微乳液溶劑蒸發(fā)法(S/O/W)制備載辛伐他汀的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)微球，測(cè)量載辛伐他汀PLGA微球的粒徑大小和分布、載藥率和藥物釋放的規(guī)律;然后，將微球與磷酸鈣骨水泥(CPC)復(fù)合構(gòu)建載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣骨水泥組織工程骨，首先對(duì)其進(jìn)行孔徑大小和分布、孔隙率和抗壓性能等材料學(xué)性質(zhì)的研究;其次，體外提取、純化、培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，觀察該組織工程骨對(duì)兔骨髓間充質(zhì)

2、干細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)成骨分化的能力，評(píng)估其體外生物相容性和成骨分化活性;最后，麻醉后手術(shù)構(gòu)建兔股骨髁骨缺損的模型，將載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨植入股骨髁外側(cè)骨缺損部位，通過(guò)影像學(xué)(Micro-CT)和組織學(xué)（HE染色）觀察其動(dòng)物體內(nèi)生物相容性和成骨活性。本項(xiàng)研究的目的足制備載辛伐他汀的PLGA載藥微球，并將其與磷酸鈣骨水泥復(fù)合后構(gòu)建組織工程骨，測(cè)定其材料學(xué)性質(zhì)，評(píng)價(jià)其體外和動(dòng)物體內(nèi)生物相容性和成骨活性，探討其對(duì)兔股骨髁骨缺損的修

3、復(fù)效果。本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)在于首次采用PLGA微球作為緩釋載體，成功構(gòu)建了可緩釋辛伐他汀的組織工程骨，有望為骨缺損的修復(fù)治療提供一種新途徑。
　　本項(xiàng)研究分為三部分:(1)載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨的制備和材料學(xué)性質(zhì)研究;(2)載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨的生物相容性和成骨分化活性的體外研究;(3)載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨的生物相容性和促進(jìn)兔股骨髁骨缺損愈合的動(dòng)物體內(nèi)研究?，F(xiàn)將本實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容介紹如

4、下。
　　第一部分 載辛伐他汀PLGA/磷酸鈣組織工程骨的制備和材料學(xué)性質(zhì)研究
　　方法:
　　運(yùn)用水包油包固態(tài)物微乳液溶劑蒸發(fā)法(S/O/W)制備單純PLGA微球、搭載辛伐他汀的PLGA載藥微球。通過(guò)掃描電鏡(SEM)觀察單純PLGA微球、搭載辛伐他汀的PLGA載藥微球的微觀形態(tài)，測(cè)量微球粒徑的大小和分布;將搭載辛伐他汀的PLGA載藥微球置于緩沖溶液中，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定其載藥和緩釋性能。分別將單純PLGA微球、搭載辛伐

5、他汀的PLGA載藥微球與磷酸鈣骨水泥混合、固化制備出單純PLGA/磷酸鈣組織工程骨和載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨。通過(guò)掃描電鏡(SEM)觀察單純PLGA/磷酸鈣組織工程骨和載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨的微觀結(jié)構(gòu);通過(guò)Micro-CT掃描檢測(cè)兩種組織工程骨的孔徑大小、分布以及孔隙率;采用萬(wàn)用測(cè)試儀檢測(cè)兩種組織工程骨的抗壓強(qiáng)度即力學(xué)性能。
　　結(jié)果:
　　運(yùn)用水包油包固態(tài)物微乳液溶劑蒸發(fā)法(S/O/W)成功制

6、備出粒徑約221.89±70.20μm的單純PLGA微球和粒徑約217.95±63.37μm的載辛伐他汀的PLGA載藥微球，兩種微球的外觀、粒徑大小和分布無(wú)顯著差異。載辛伐他汀PLGA微球的載藥率為85.30±4.3％，在前7天可緩釋約60％的藥量，并可緩慢釋放辛伐他汀約21天。單純PLGA/磷酸鈣組織工程骨和載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨均具有良好的三維孔隙結(jié)構(gòu)。單純PLGA/磷酸鈣組織工程骨的孔隙率約為64.50±4.27％

7、，孔徑約為234.65±65.36μm，抗壓強(qiáng)度約為6.34±1.41Mp;載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨的孔隙率約為65.95±3.30％，孔徑約為225.74±57.02μm，抗壓強(qiáng)度約為6.52±1.73Mp。兩種組織工程骨的孑L隙率、孔徑和抗壓強(qiáng)度無(wú)顯著差異。
　　結(jié)論:
　　1.運(yùn)用水包油包固態(tài)物微乳液溶劑蒸發(fā)法(S/O/W)可成功制備出符合材料學(xué)要求的載藥PLGA微球。
　　2.PLGA微球可作為辛

8、伐他汀的載體和緩釋體。隨著載藥微球的降解，可使辛伐他汀產(chǎn)生突釋效應(yīng)且緩慢釋放達(dá)21天。
　　3.載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨具有優(yōu)異的藥物緩釋性能、良好的三維連通性、合適的孔隙孔徑結(jié)構(gòu)和抗壓性能。
　　第二部分 載辛伐他汀/PLGA磷酸鈣組織工程骨的生物相容性和成骨分化活性的體外研究
　　方法:
　　過(guò)量麻醉后取1月齡新西蘭大白兔的股骨和脛骨，F(xiàn)icoll密度梯度離心法提取原代兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，體外培

9、養(yǎng)、傳代，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)。流式細(xì)胞儀鑒定后，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第四代兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別接種于單純PLGA/磷酸鈣組織工程骨和載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨。培養(yǎng)7天后，運(yùn)用掃描電鏡觀察接種細(xì)胞的形態(tài);運(yùn)用CCK-8活細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)接種細(xì)胞的黏附和增殖情況;運(yùn)用流式細(xì)胞周期檢測(cè)組織工程骨對(duì)于接種細(xì)胞的周期影響;對(duì)接種細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶活性測(cè)定和茜素紅S染色以評(píng)估組織工程骨的成骨分化活性。
　　結(jié)果:
　

10、　單純PLGA/磷酸鈣組織工程骨和載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨均對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有著良好的生物相容性，而后者表現(xiàn)出更強(qiáng)的成骨分化活性。兩種組織工程骨均與細(xì)胞粘附性良好，接種于載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨的細(xì)胞形態(tài)呈多角狀，且細(xì)胞的數(shù)量更多。相對(duì)于單純PLGA/磷酸鈣組織工程骨組和空白對(duì)照組，載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨組的細(xì)胞增殖、處于細(xì)胞分裂期的細(xì)胞數(shù)、堿性磷酸酶活性以及茜素紅S染色陽(yáng)性的礦化結(jié)節(jié)數(shù)日和

11、范圍均明顯增高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　Ficoll密度梯度離心聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法可分離、培養(yǎng)出純度較高的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨具有良好的生物相容性和成骨分化活性，其緩釋的辛伐他汀可促進(jìn)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其成骨分化。
　　第三部分 載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨的生物相容性和促進(jìn)兔股骨髁骨缺損愈合的動(dòng)物體內(nèi)研究
　　方法:
　　建

12、立新西蘭大白兔單側(cè)股骨髁骨缺損模型30只（6周齡，雌雄各半，體重約1.0kg;山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可編號(hào);SYXK2013-0001），按照隨機(jī)原則分為A、B、C三組，每組10只。A組為空白對(duì)照組，即假手術(shù)組，僅建立股骨髁骨缺損;B組為單純PLGA/磷酸鈣組織工程骨組，將單純PLGA/磷酸鈣組織工程骨植入骨缺損部位;C組載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨組，將載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨植入骨缺損部位。于術(shù)后6、1

13、2周時(shí)通過(guò)大體觀察、Micro-CT掃描（二維掃描分析和三維重建）和病理組織切片觀察，評(píng)估骨缺損的愈合情況，并分析各組骨缺損的愈合程度有無(wú)顯著差異。
　　結(jié)果:
　　植入組織工程骨后6周和12周時(shí)，載辛伐他汀/PLGA/磷酸鈣組織工程骨組的骨缺損修復(fù)的速度和質(zhì)量均顯著優(yōu)于空白對(duì)照組和單純PLGA/磷酸鈣組織工程骨組。標(biāo)本大體觀察:術(shù)后6周和12周時(shí)，C組骨缺損的愈合情況均要優(yōu)于A組和B組。Micro-CT掃描分析:C組骨覆蓋

14、率(Bone Coverage)于6周和12周時(shí)分別為25.78±6.89％和68.06±11.62％，骨密度值（Bone Mineral Density）于6周和12周時(shí)分別為90.92±9.85 mg/cm3和201.98±12.23 mg/cm3，顯著優(yōu)于A組（骨覆蓋率:6周時(shí)3.40±2.25％，12周時(shí)6.10±4.48％;骨密度值:6周時(shí)31.04±5.75 mg/cm3，12周時(shí)52.80±8.84 mg/cm3）和B組（

15、骨覆蓋率:6周時(shí)12.89±5.75％，12周時(shí)29.24±9.25％;骨密度值:6周時(shí)59.28±5.75 mg/cm3，12周時(shí)52.08±10.78 mg/cm3）。Micro-CT三維重建:C組股骨髁骨缺損愈合的速度和質(zhì)量均顯著高于A組和B組，12周時(shí)骨缺損處已經(jīng)完全愈合，和周?chē)墙M織無(wú)明顯界限。A組骨缺損處未見(jiàn)明顯愈合，12周時(shí)仍有大塊缺損;B組骨缺損處見(jiàn)部分愈合，12周時(shí)仍然遺留部分缺損。組織學(xué)檢查（HE染色）:C組骨小梁及