高糖高脂飲食誘導(dǎo)大鼠胰島細(xì)胞的損傷時程變化特征的初步研究及新型抗糖尿病藥物DPP-IV抑制劑的篩選.pdf

1、糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一種多病因、以高血糖為特征的代謝紊亂綜合征。近十年來，DM發(fā)病率在全球范圍內(nèi)迅速攀升，由DM并發(fā)癥導(dǎo)致的死亡人數(shù)僅次于心腦血管疾病、惡性腫瘤，成為人類健康的“第三殺手”，又被稱為“不死的癌癥”。
　　 90-95％DM為2型糖尿病(Type2 Diabetes Mellitus，T2DM)，也稱非胰島素依賴性DM。大量的基礎(chǔ)與臨床研究表明，胰島素抵抗(insulin resis

2、tance，IR)和胰島β細(xì)胞分泌功能不全是T2DM發(fā)病的兩個重要病理生理基礎(chǔ)。由于胰島β細(xì)胞最終決定T2DM的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，而現(xiàn)有治療措施不能有效逆轉(zhuǎn)或防止T2DM患者胰島β細(xì)胞功能的進(jìn)行性衰竭和喪失。因此，發(fā)展具有胰島β細(xì)胞保護(hù)作用的抗DM藥物成為醫(yī)藥研究的新方向。然而，由于人體胰島β細(xì)胞連續(xù)觀察的局限性，目前對胰島β細(xì)胞損傷機(jī)制的認(rèn)識仍十分粗淺，缺乏系統(tǒng)性研究。研究表明，DM患者初診時，其胰島β細(xì)胞功能就僅為正常時的50％，β細(xì)胞數(shù)

3、量減少約60％。因而，研究DM前或胰島素耐受形成過程中胰島β細(xì)胞損傷機(jī)制具有重要意義。本課題研究目的是：(1)通過對高糖高脂飲食(High sucrose-fat diets，HSFDs)誘導(dǎo)胰島素耐受大鼠胰島細(xì)胞形態(tài)及功能的時程變化特征的研究，了解長期胰島素耐受對胰島細(xì)胞損傷的規(guī)律，為胰島β細(xì)胞損傷的分子機(jī)制的研究以及抗DM藥物藥效學(xué)評價提供基礎(chǔ)信息；(2)建立分子水平二肽基肽酶-Ⅳ(Dipeptidyl Peptidase-Ⅳ，DP

4、P-Ⅳ)抑制劑的篩選模型，完成本室基于DPP-Ⅳ結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成的新化合物的篩選。
　　 研究工作有兩部份內(nèi)容。
　　 第一部分：HSFDs誘導(dǎo)大鼠胰島素細(xì)胞損傷的時程變化特征的初步研究。
　　 本工作主要基于高糖、高脂誘發(fā)IR、損傷胰島功能，選擇國際標(biāo)準(zhǔn)高糖高脂飼料，飼喂Wistar大鼠，誘導(dǎo)胰島素耐受，共持續(xù)59wk。通過動態(tài)監(jiān)測大鼠FBG(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和糖負(fù)荷后2小時后(

5、PBG-2hr)血糖水平，初步判斷大鼠IR程度，選擇5、17、23、41和63wk，對胰島形態(tài)與D細(xì)胞的功能進(jìn)行研究，包括腹腔注射葡萄糖，觀察大鼠Ⅰ相胰島素分泌能力；對胰腺組織切片進(jìn)行了胰島細(xì)胞顯微、亞顯微結(jié)構(gòu)觀察；胰島素、胰高血糖素、BrdU免疫組織化學(xué)染色、圖像分析；采用多參數(shù)免疫磁珠試劑盒測定了胰島分泌及促分泌激素[胰島素、胰高血糖素及以高血糖素樣肽-1(Glucagon-Like Peptide-1，GLP-1)]的血清水平。結(jié)

6、果如下：
　　 1.HSFDs誘導(dǎo)大鼠的體重增長顯著高于正常對照大鼠，差異自實(shí)驗(yàn)啟動1wk后出現(xiàn)，隨時間延長，愈加明顯；HSFDs誘導(dǎo)大鼠腹內(nèi)脂肪積聚明顯增多；至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，兩組脂體系數(shù)分別為(11.33±2.24)％和(6.41±0.66)％。大鼠血脂水平隨時間呈緩慢升高趨勢，HSFDs在早期(5、17wk)和晚期(41wk后)促進(jìn)了血清甘油三酯(Triglyceride，TG)升高，在41、63wk作用更為顯著。HSFDs不誘

7、發(fā)明顯的血清總膽固醇(Total Cholesterol，TCH)和游離脂肪酸(Free fatty acids，F(xiàn)FAs)的增加。
　　 2.HSFDs誘導(dǎo)2wk起，大鼠PBG-2hr后血糖水平開始升高，4wk顯著高于正常對照大鼠，至12wk血糖水平最高，保持至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。在實(shí)驗(yàn)期間，兩組動物FBG水平變化總體趨勢一致。在10～32wk期間，HSFDs誘導(dǎo)大鼠FBG高于正常對照大鼠，在22～30wk有顯著差異；其他時間段兩組動物

8、FBG水平基本一致。根據(jù)實(shí)驗(yàn)全程大鼠PBG-2hr血糖和FBG動態(tài)監(jiān)測的結(jié)果，將HSFDs誘導(dǎo)大鼠胰島素耐受形成及發(fā)展過程大致分5個階段，0～16wk(血糖呈逐漸上升階段)，16～22wk(血糖峰值保持期)；22～36wk(呈現(xiàn)下降趨勢)，36～46wk(血糖谷值保持期)，46wk后(再緩慢升高階段)。腹腔注射糖耐量結(jié)果顯示，HSFDs誘導(dǎo)17wk之后，胰島素Ⅰ相分泌開始降低，到23wk，顯著降低；41和63wk有恢復(fù)趨勢，但外周胰島素

9、耐受程度明顯增強(qiáng)。因此，5、17、23、41和63wk為HSFDs誘導(dǎo)大鼠胰島素耐受不同階段的代表性時期。可能代表了耐受形成早期，耐受發(fā)展期，F(xiàn)BG紊亂期，代償期，失代償期。
　　 3.大鼠胰腺組織顯微與亞顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，HSFDs時間依賴性誘發(fā)胰島細(xì)胞的損傷，但至63wk，有逆轉(zhuǎn)跡象。Hematoxylin&Eosin(HE)染色結(jié)果表明，HSFDs誘導(dǎo)17wk后，大鼠胰島內(nèi)部β細(xì)胞體積出現(xiàn)膨脹，β細(xì)胞數(shù)量增多，胰島體積開始

10、增大；23wk時，HSFDs誘導(dǎo)大鼠胰島，在形態(tài)上表現(xiàn)為胰腺內(nèi)外分泌部界限模糊，細(xì)胞分布不均勻，胰島細(xì)胞開始出現(xiàn)空泡；至41wk時；HSFDs誘導(dǎo)大鼠胰島結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破損，表現(xiàn)為：胰島團(tuán)結(jié)構(gòu)松散，胰島內(nèi)部異位脂肪沉積，細(xì)胞空泡化極嚴(yán)重；至63wk，HSFDs誘導(dǎo)大鼠胰島形態(tài)較41wk有所好轉(zhuǎn)，胰島細(xì)胞重新團(tuán)聚，脂肪沉積明顯減少，核明顯增多。電鏡觀察表明，模型大鼠誘導(dǎo)17wk時，β細(xì)胞已經(jīng)表現(xiàn)出損傷跡象，線粒體表達(dá)量增高；23wk時，HSFD

11、s誘導(dǎo)大鼠胰島在亞顯微結(jié)構(gòu)上，表現(xiàn)為胰島β細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、深染，胰島素顆粒減小；至41wk時，β細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、深染且邊緣化，線粒體膨脹、脊結(jié)構(gòu)紊亂。HSFDs對胰島α細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的影響較β細(xì)胞弱，由于獲得的有效細(xì)胞數(shù)量較少，未能觀察到HSFDs對α細(xì)胞的顯著影響，僅觀察到，17wk模型大鼠α細(xì)胞核皺縮，細(xì)胞內(nèi)胰高血糖素分泌顆粒比正常對照??；61wkα細(xì)胞內(nèi)胰高血糖素分泌顆粒明顯減少，這一現(xiàn)象也與測定的血清胰高血糖素含量的變化規(guī)律相吻

12、合。
　　 4.胰島組織切片免疫組化染色結(jié)果顯示，胰島細(xì)胞增殖主要與鼠齡相關(guān)，HSFDs誘導(dǎo)大鼠僅在41wk時，新生細(xì)胞增殖數(shù)量高于同期正常飲食大鼠，在63wk時，細(xì)胞增殖數(shù)量明顯減少；HSFDs誘導(dǎo)時間依賴的增加大鼠胰島素的合成，至41wk、63wk差異顯著。而胰高血糖素僅在63wk呈現(xiàn)合成增加的現(xiàn)象。血清胰島素、胰高血糖素及GLP-1檢測發(fā)現(xiàn)，HSFDs明顯促進(jìn)胰島素分泌，并呈現(xiàn)時間依賴性升高趨勢；HSFDs時間依賴地降低血

13、清GLP-1水平；與胰島α細(xì)胞胰高血糖素合成增加相反，63wk時，HSFDs飲食大鼠血清胰高血糖素水平顯著降低。
　　 綜上所述，本課題采用HSFDs成功誘導(dǎo)了胰島素耐受大鼠，該大鼠同時以腹部肥胖和血清TG紊亂為特征。在持續(xù)59wk的胰島素耐受病程中，大鼠IR程度日趨嚴(yán)重，胰島素合成和分泌量時間依賴性增加，但并未誘發(fā)出高糖血癥。伴隨胰島耐受的發(fā)展，HSFDs誘發(fā)大鼠胰島細(xì)胞進(jìn)行性損傷，表現(xiàn)為17wk出現(xiàn)胰島細(xì)胞膨大，23wk胰島

14、素急性分泌功能一過性降低，41wk細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷最嚴(yán)重并開始出現(xiàn)代償性增生，至63wk逐漸失代償。HSFDs與DM的胰島細(xì)胞損傷特征不同。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，伴隨大鼠月齡增加，正常飲食大鼠同樣出現(xiàn)胰島素耐受現(xiàn)象，63wk時，其胰島素耐受程度與HSFDs誘導(dǎo)17～23wk的大鼠相當(dāng)，但其新生胰島細(xì)胞數(shù)量明顯增加，形態(tài)僅有膨脹、細(xì)胞空泡變性及偶有纖維化的現(xiàn)象。
　　 第二部分：新型抗DM新藥DPP-Ⅳ抑制劑的篩選。
　　 通過誘

15、導(dǎo)Caco-2細(xì)胞分化高表達(dá)DPP-Ⅳ，建立分子水平DPP-Ⅳ抑制劑的篩選方法，對本實(shí)驗(yàn)室靶向DPP-Ⅳ設(shè)計(jì)合成的143個新化合物進(jìn)行了篩選；采用正常昆明(KM)小鼠、肝臟葡萄糖激酶敲除DM小鼠模型以及小鼠急性毒性試驗(yàn)對活性化合物的體內(nèi)降糖活性和選擇性進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，來源于分化Caco-2細(xì)胞的DPP-Ⅳ的粗制酶具有較好的活性，建立的分子水平的篩選模型能夠高通量地用于抑制劑的篩選；143個受試化合物中，化合物Max-1、Max-2

16、和143的活性較高，其IC50分別為294.36±31.08(nM)、340.44±42.53(nM)和267.75±14.06(nM)，和陽性藥相似；然而口服給予KM小鼠和肝臟葡萄糖激酶敲除DM小鼠，10mg/kg的Max-1、Max-2均未表現(xiàn)出降低糖負(fù)荷后血糖水平的作用，相反，Max-1和Max-2分別在DM小鼠和KM小鼠上表現(xiàn)出現(xiàn)升高糖作用。小鼠急性毒性結(jié)果表明，口服化合物Max-1、Max-2和143的LD50分別為15.6m