高脂致糖尿病大鼠β細(xì)胞功能障礙的機(jī)制及胰島素治療作用的研究.pdf

1、目的：觀察高脂對糖尿病(DM)大鼠β細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制，并探討胰島素治療的作用。 方法：采用小劑量鏈脲佐菌素(STZ，25mg/kg體重)和高脂飲食誘導(dǎo)的方法建立DM大鼠模型。DM大鼠隨機(jī)分為3組：DM高脂飲食(DH)組、DM正常飲食(DN)組和DM高脂飲食及胰島素治療(DHI)組；正常Wistar大鼠為正常對照(NC)組。DH組及DHI組大鼠給予高脂喂養(yǎng)，DN組和NC組大鼠給予正常飲食，同時DHI組大鼠給予胰島素治療。10

2、周后，行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)，測定血糖和血胰島素值，并根據(jù)血糖和血胰島素值計算糖負(fù)荷后胰島素增值與血糖增值的比值(△I30/△G30)和修正的β細(xì)胞胰島素分泌指數(shù)(MBCI)。取胰腺：胰頭部分做石蠟切片，胰尾部分液氮保存。SABC方法定位β細(xì)胞內(nèi)的胰島素，半定量分析胰島素蛋白的表達(dá)，并測定相對β細(xì)胞數(shù)量和平均β細(xì)胞面積。RT-PCR技術(shù)半定量分析胰島素、絲氨酸軟脂酰轉(zhuǎn)移酶(SPT)及Caspase-3基因表達(dá)。酸乙醇方法抽提胰

3、腺內(nèi)胰島素并測定。免疫熒光雙標(biāo)記和免疫印跡法測定β細(xì)胞內(nèi)的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白表達(dá)。免疫熒光雙標(biāo)記法測定Bcl-2蛋白表達(dá)。碘化丙啶(PI)法測定β細(xì)胞的凋亡。同時測定血和胰腺內(nèi)的FFA和TG。 結(jié)果：與NC組相比，DH組和DN組的血和胰腺內(nèi)的FFA和TG增加，胰島素蛋白及基因表達(dá)和胰島素含量下降；葡萄糖刺激的胰島素分泌曲線低平；△I30/△G30和MBCI下降，其中以DH組更明顯(P＜0.05)。 與NC組相

4、比，DN組和DH組的相對β細(xì)胞數(shù)量和平均β細(xì)胞面積減少；β細(xì)胞的凋亡、SPT和Caspase-3基因表達(dá)水平均升高，而Bcl-2和PCNA的蛋白表達(dá)降低，且以DH組的改變最顯著(P＜0.05～P＜0.01)。 與DH組相比，DHI組大鼠經(jīng)過胰島素治療后，血FFA和TG水平雖然沒有明顯改善，但是胰腺內(nèi)的TG、FFA明顯降低。同時胰島素基因及蛋白表達(dá)和胰島素含量增加；胰島素分泌功能、△I30/△G30和MBCI改善；相對β細(xì)胞數(shù)量和

5、平均β細(xì)胞面積增加；β細(xì)胞凋亡、SPT和Caspase-3基因的表達(dá)水平均降低；Bcl-2和PCNA的表達(dá)改善(P＜0.05～P＜0.01)。 結(jié)論：長期高脂可促使小劑量STZ和高脂飲食誘導(dǎo)的DM大鼠胰島素分泌功能障礙，且β細(xì)胞分泌功能障礙與胰島素基因和蛋白表達(dá)下降致β細(xì)胞內(nèi)的胰島素含量降低及β細(xì)胞增殖降低，凋亡增加致β細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān)。胰島素治療對高脂所致的上述作用有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用部分和胰腺內(nèi)FFA及TG沉積改善相關(guān)。

6、 第一部分DM大鼠模型的建立及其代謝特點的研究 目的：觀察小劑量STZ和高脂飲食誘導(dǎo)的DM大鼠的血糖、血脂(FFA和TG)、血胰島素、胰島素敏感性指數(shù)(ISI)和胰島素抵抗指數(shù)的特點。 方法：雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為NC組和模型組。模型組大鼠給予STZ(25mg/kg體重)腹腔注射，NC組大鼠給予相應(yīng)劑量的檸檬酸緩沖液。2w后行OGTT，糖耐量異常者給予高脂飲食。NC組大鼠仍給予正常飲食。模型組大鼠飼以高脂飲

7、食8w后行OGTT，測定血糖，確定DM大鼠模型有無建立。測定DM大鼠血游離脂肪酸(FFA)、血甘油三酯(TG)、血膽固醇(Chol)及血胰島素，并根據(jù)血糖和血胰島素值計算ISI和胰島素抵抗指數(shù)。 結(jié)果：DM組大鼠0min、30min、60min和120min的血糖分別為NC組大鼠對應(yīng)時點血糖的1.5倍、1.4倍、1.5倍和1.6倍，且差異均具有顯著性(P＜0.01)；同時血FFA、TG和Chol也明顯增加，分別為NC組的1.9倍

8、(P＜0.01)、1.4倍(P＜0.01)和1.6倍(P＜0.01)。DM組大鼠空腹胰島素為NC組大鼠的1.2倍(P＜0.05)，并且ISI下降，胰島素抵抗指數(shù)增加，與NC組相比，差異具有顯著性(P＜0.01、P＜0.01)。 結(jié)論：用小劑量STZ和高脂飲食誘導(dǎo)的DM大鼠具備高血糖、脂代謝紊亂、胰島素抵抗(IR)和高胰島素血癥的特點。 第二部分高脂對DM大鼠胰島素基因和蛋白表達(dá)、胰島素含量及胰島素分泌功能的影響

9、目的：觀察高脂對DM大鼠β細(xì)胞胰島素基因和蛋白表達(dá)、胰島素含量和胰島素分泌功能的影響。 方法：DM大鼠隨機(jī)分為2組：DH組和DN組；正常Wistar大鼠為NC組。DH組大鼠繼續(xù)高脂喂養(yǎng)，DN組大鼠正常飼料喂養(yǎng)。10周后，三組大鼠行OGTT，測定0min、30min、60min和120min的血糖和胰島素值。并根據(jù)血糖和血胰島素值計算△I30/△G30和MBCI。取胰腺：胰頭部分做石蠟切片，胰尾部分液氮保存。SABC方法定位β細(xì)胞

10、內(nèi)的胰島素，并半定量分析胰島素蛋白的表達(dá)。RT-PCR技術(shù)半定量分析胰島素基因表達(dá)，酸乙醇方法抽提胰腺內(nèi)胰島素并測定。同時測定血和胰腺內(nèi)的FFA和TG。 結(jié)果：與NC組相比，DH組和DN組的血和胰腺內(nèi)的FFA和TG增加，葡萄糖刺激的胰島素分泌曲線低平，△I30/△G30和MBCI顯著下降，以DH組為著，差異均具有顯著性(P＜0.05～P＜0.01)。DN組和DH組胰島素蛋白和基因表達(dá)及胰島素含量均明顯低于NC組，其中以DH組降低

11、更明顯(P＜0.05)。 結(jié)論：長期高脂可損傷DM大鼠胰島素基因和蛋白的表達(dá)，同時細(xì)胞內(nèi)的胰島素含量降低，β細(xì)胞胰島素分泌功能顯著下降。且高脂導(dǎo)致的上述改變可能和胰腺內(nèi)的脂質(zhì)沉積有關(guān)。 第三部分高脂對DM大鼠β細(xì)胞數(shù)量的影響及β細(xì)胞凋亡可能的影響因素 目的：觀察高脂對DM大鼠β細(xì)胞增殖、β細(xì)胞凋亡及β細(xì)胞數(shù)量的影響及凋亡的相關(guān)因素。 方法：SABC法定位NC組、DN組和DH組大鼠β細(xì)胞內(nèi)的胰島素后，測定平

12、均β細(xì)胞面積和相對B細(xì)胞數(shù)量；免疫熒光雙標(biāo)記和免疫印跡法測定β細(xì)胞內(nèi)的PCNA蛋白表達(dá)；免疫熒光雙標(biāo)記法測定Bcl-2蛋白表達(dá)；PI法測定β細(xì)胞的凋亡；并應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白絲氨酸軟脂酰轉(zhuǎn)移酶(SPT)和Caspase-3的基因表達(dá)。 結(jié)果：DN組和DH組的相對β細(xì)胞數(shù)量和平均β細(xì)胞面積均較NC組減少(P＜0.05～P＜0.01)，且以DH組的改變顯著(P＜0.05)。DN組的β細(xì)胞的凋亡率、SPT和Caspas

13、e-3基因表達(dá)水平較NC組升高，而Bcl-2和PCNA的蛋白表達(dá)較NC組下降(P＜0.05)。DH組的β細(xì)胞凋亡、SPT和Caspase-3基因表達(dá)的升高和Bcl-2及PCNA蛋白表達(dá)的下降則進(jìn)一步加劇(vsDN組，P＜0.05～P＜0.01)。 結(jié)論：高脂可導(dǎo)致DM大鼠β細(xì)胞數(shù)量減少，這種數(shù)量減少是由于β細(xì)胞凋亡增加，增殖能力降低所致。β細(xì)胞凋亡可能系SPT和Caspase-3表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)下降所致。 第四部

14、分胰島素治療對高脂導(dǎo)致的DM大鼠β細(xì)胞功能障礙的作用及機(jī)制 目的：胰島素治療對高脂導(dǎo)致的DM大鼠β細(xì)胞功能障礙的作用及可能的機(jī)制。方法：DM大鼠隨機(jī)分為3組：DH組、DN組和DHI組，及NC組。DH組和DHI組大鼠高脂喂養(yǎng)，DN組和NC組大鼠給予正常飲食，DHI組大鼠同時給予胰島素治療。胰島素治療10周后，行OGTT及取胰腺組織，測定指標(biāo)同第二、第三部分。 結(jié)果：與DH組相比，DHI組大鼠經(jīng)過胰島素治療后，血FFA和TG

15、水平雖然沒有明顯改善，但是胰腺內(nèi)的TG、FFA明顯降低。胰島素基因及蛋白表達(dá)和胰島素含量增加，分別為DH組的4.41倍(P＜0.01)、2.11(P＜0.01)倍和1.47倍(P＜0.05)；胰島素分泌功能較DH組有所恢復(fù)，△I30/△G30和MBCI高于DH組(P＜0.05～P＜0.01)。同時相對β細(xì)胞數(shù)量和平均β細(xì)胞面積較DH組得以改善(P＜0.01、P＜0.05)；β細(xì)胞凋亡、SPT和Caspase-3基因的表達(dá)、Bcl-2和P