低氧調(diào)節(jié)Wnt-Notch通路串話及其對成骨細(xì)胞增殖影響的初步探討.pdf

1、在許多骨科疾病，如骨折、關(guān)節(jié)炎、股骨頭壞死以及骨腫瘤中，低氧環(huán)境是常見的細(xì)胞病理微環(huán)境之一。低氧微環(huán)境可引起細(xì)胞巨烈的生物學(xué)變化。在這些骨組織疾病中，成骨細(xì)胞是受到低氧環(huán)境影響的重要細(xì)胞類型之一。研究在低氧環(huán)境下成骨細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的規(guī)律，有利于理解各類骨組織疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。創(chuàng)傷常導(dǎo)致血供的減少和低氧環(huán)境，在骨折部位，由于組織血流中斷等諸多因素，使得骨折局部的氧濃度降低。在這種異常的低氧狀態(tài)下，低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia indu

2、ced factor，HIF)途徑是各種組織器官在對局部氧環(huán)境進(jìn)行感受和應(yīng)答過程中的核心途徑。對氧平衡的調(diào)節(jié)能力是器官進(jìn)行有氧代謝的關(guān)鍵特性。組織細(xì)胞為了適應(yīng)低氧環(huán)境，其低氧調(diào)控調(diào)控基因會(huì)影響到眾多發(fā)育、生理及病例過程，這使得氧敏感通路成為了一個(gè)極佳的再生藥物調(diào)控靶點(diǎn)。低氧誘導(dǎo)因子(HIF)是調(diào)控細(xì)胞對低氧反應(yīng)產(chǎn)生基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子。HIF調(diào)控基因涉及了血管生成、厭氧代謝、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞生存/死亡、以及紅細(xì)胞生成等諸多方

3、面。
　　事實(shí)上，HIF-1除通過經(jīng)典信號通路途徑調(diào)節(jié)其下游靶基因外，還常常直接或間接地影響了其他保守信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本文中著重討論的是HIF-1α及HIF信號通路對Wnt、Notch信號通路串話的影響。Wnt、Notch信號通路都是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高度保守的信號通路，它們可參與到骨組織細(xì)胞的各類生理病理作用之中。
　　Notch信號通路是幾乎存在于各類組織細(xì)胞中與分化相關(guān)的重要細(xì)胞信號通路。在骨骼系統(tǒng)的發(fā)育過程中，骨軟骨

4、前體細(xì)胞必需通過Notch信號來維持其多向分化能力以防止過早分化為成骨細(xì)胞。因此在許多病理狀態(tài)下，過度激活Notch信號通路會(huì)抑制成骨細(xì)胞的成熟，造成骨發(fā)育不良。此外，軟骨細(xì)胞的增生肥大和終末分化抑制更是離不開Notch信號通路的作用。在骨科疾病研究中發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路在骨肉瘤和骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。
　　另一方面，Wnt通路則是調(diào)控細(xì)胞增殖分化的重要信號通路。Wnt配體可通過β-catenin依賴性及β-ca

5、tenin非依賴性信號通路對多種器官的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持產(chǎn)生重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路在骨組織生長發(fā)育中起到了關(guān)鍵作用
　　由于在研究中發(fā)現(xiàn)Wnt與Notch通路相互聯(lián)系非常緊密，以至于有研究者建議將其聯(lián)系起來命名為“Wntch”通路。“Wntch”信號通路的主要作用是維持個(gè)體中組織細(xì)胞生長發(fā)育過程的正常進(jìn)行。同時(shí)，“Wntch”的活性還能調(diào)節(jié)組織中干細(xì)胞、祖細(xì)胞及分化成熟細(xì)胞之間的平衡。
　　盡管有

6、很多報(bào)道對HIF與Wnt、Notch信號通路的作用分別進(jìn)行了研究，但很少有研究將Wnt、Notch信號通路串話的機(jī)制聯(lián)系起來。事實(shí)上，作為信號通路調(diào)控的重要機(jī)制，在低氧環(huán)境及HIF-1作用環(huán)境下，Wnt-Notch通路的串話是否受到了影響同樣是值得研究的問題。
　　在所有影響Wnt-Notch信號通路偶聯(lián)的環(huán)境因素中，由于在多種病理性骨微環(huán)境中經(jīng)常出現(xiàn)低氧的情況，低氧環(huán)境及低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-induciblefa

7、ctor-1α，hif-1α)受到了廣泛的關(guān)注。低氧不僅啟動(dòng)了低氧誘導(dǎo)因子hif-1α信號通路，而且還對骨發(fā)育生長中具有重要作用的其它信號通路產(chǎn)生了影響。其中便包括了Wnt及Notch信號通路等。根據(jù)一些報(bào)道中所述，hif-1α可通過各種直接或間接的方式引起Notch受體胞內(nèi)區(qū)蛋白(Notch intraCellular Domain，NICD)水平的上升，從而使Notch信號通路的上調(diào)。然而，低氧及hif-1α對Wnt-Notch信號

8、通路串話的作用仍然具有爭議。特別地，在近期的一些實(shí)驗(yàn)中，對小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞系進(jìn)行低氧環(huán)境培養(yǎng)時(shí)，可觀察到Wnt信號通路活性的下調(diào)。然而，Wnt信號通路在低氧作用下的調(diào)節(jié)方式及其分子機(jī)制仍未闡明。
　　目的:
　　從低氧對Wnt-Notch通路串話影響的角度，闡述低氧對成骨細(xì)胞增殖調(diào)控的一系列機(jī)制。以期較為合理地解釋此前研究中所存在的諸多矛盾，為關(guān)于低氧對成骨作用影響的一系列研究提供進(jìn)一步證據(jù)支持。
　　

9、方法:
　　1.通過氯化鈷化學(xué)誘導(dǎo)小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1，建立化學(xué)細(xì)胞性低氧模型，并通過PCR及Western Blot等手段驗(yàn)證模型建立效果。
　　2.通過siRNA雙鏈寡核苷酸對MC3T3-E1小鼠成骨細(xì)胞系進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，分別干擾β-catenin及Hif-1α的mRNA基因表達(dá)，并通過PCR驗(yàn)證干擾效率。
　　3.通過前期實(shí)驗(yàn)建立的低氧模型及β-catenin及Hif-1α基因干擾模型，利用CCK-8增殖

10、活性檢測及流式細(xì)胞凋亡檢測等手段，觀察低氧條件下成骨細(xì)胞的增殖情況;并通過PCR及Western Blot初步觀察其分子水平變化，并探討可能分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):在經(jīng)過氯化鈷處理?xiàng)l件下培養(yǎng)成骨細(xì)胞48h、72h后，成骨細(xì)胞的增殖能力下降，同時(shí)其凋亡率明顯上升。通過對CCK-8及流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡率、存活率檢測，確認(rèn)了在Notch信號通路阻斷狀態(tài)下，氯化鈷誘導(dǎo)的低氧條件可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖活

11、性。并且在Notch信號通路抑制劑DAPT濃度一定的條件下，低氧所能促進(jìn)的成骨細(xì)胞增殖程度與氯化鈷濃度在一定范圍呈正相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過Western Blot檢測Notch信號通路信使蛋白表達(dá)量，并通過q-PCR檢測信號通路靶基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在Notch信號受到阻斷劑如DAPT等作用的情況下，隨著氯化鈷化學(xué)濃度的增高，Notch信號通路本身并未受到上調(diào)。
　　與Notch信號通路的情況不同的是，β-cate

12、nin的活性蛋白水平和Wnt信號通路靶基因的表達(dá)水平受到氯化鈷模擬低氧刺激后有輕微上升。進(jìn)一步在比較低氧下不同程度的Notch信號通路阻斷環(huán)境中，β-catenin基因敲減狀態(tài)的成骨細(xì)胞系(β-catenin KD)及野生型成骨細(xì)胞系(WT)之間的增殖能力時(shí)可發(fā)現(xiàn)，野生型成骨細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力隨Notch信號通路的阻斷程度在一定范圍內(nèi)上升，而β-catenin基因敲減后的成骨細(xì)胞系的增殖能力隨著Notch信號通路的阻斷程度上升而受到了一

13、定的抑制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)hif-1α基因表達(dá)敲減后，在Notch信號通路的阻斷條件中，氯化鈷模擬低氧不能導(dǎo)致Wnt信號的上調(diào)。相反地，隨著Notch信號通路阻斷程度的增強(qiáng)，β-Catenin蛋白水平及wnt信號通路靶基因的表達(dá)水平明顯下降。同時(shí)，在hif-1α基因敲減后的成骨細(xì)胞系中，在Notch信號通路阻斷的條件下，氯化鈷的濃度對成骨細(xì)胞增殖無明顯的影響。此外，通過在氯化鈷模擬低氧的條件下，對野生型成骨細(xì)胞系及hif-1

14、α基因敲減后成骨細(xì)胞系之間的比較，可發(fā)現(xiàn)當(dāng)hif-1α基因敲減后，成骨細(xì)胞中NICD的表達(dá)量明顯減少，
　　同時(shí)，為了驗(yàn)證γ-分泌酶抑制劑的應(yīng)用意義，通過CCK-8試驗(yàn)對不同濃度DAPT對常氧環(huán)境下成骨細(xì)胞或低氧環(huán)境成骨細(xì)胞的增殖影響進(jìn)行觀察可發(fā)現(xiàn)，常氧條件下成骨細(xì)胞的增殖隨DAPT濃度的增加而下降，而低氧狀態(tài)下成骨細(xì)胞的增殖會(huì)隨著DAPT濃度的上升在一定范圍內(nèi)逐漸上升。
　　結(jié)論:
　　本研究結(jié)果主要證明了低氧環(huán)境下

15、Hif-1α可以誘導(dǎo)調(diào)控Wnt信號通路的變化。同時(shí)，低氧環(huán)境可誘導(dǎo)Notch信號通路的激活，由于Notch通路的激活可對Wnt信號通路的產(chǎn)生直接或間接的交互作用，使Wnt信號通路活性受到抑制，并同時(shí)抑制了細(xì)胞增殖能力。當(dāng)Notch信號激活時(shí)，Wnt信號的活性會(huì)受到相對的抑制。因此，在低氧環(huán)境中，阻斷Hif1α誘導(dǎo)的Notch信號通路激活過程，可解救低氧環(huán)境造成的Wnt信號活性下調(diào)。這一現(xiàn)象表明了在低氧環(huán)境中，Wnt-Notch信號通路串

16、話在成骨細(xì)胞增殖中起到重要調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　本研究證明Wnt-Notch信號串話在低氧環(huán)境下成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為中，至少起到三方面的影響:1.低氧環(huán)境可不同程度地參與調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt及Notch信號通路的活性，從而使得低氧環(huán)境中的Wnt-Notch信號通路串話作用更為明顯，并以此調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為;2.受低氧條件激活的Notch信號通路可抑制Wnt信號活性并抑制Wnt信號靶基因所誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖作用;3.靶向γ-分泌酶的藥物可有效地