液、固態(tài)發(fā)酵法制備雙益生菌菌劑的研究.pdf

1、益生菌有很多生理功能，最重要的是可以促進(jìn)腸道有益微生物的繁殖，降低病原菌數(shù)量。益生菌制劑以無毒、無殘留、無副作用、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，使其成為了有效的抗生素替代物。本試驗(yàn)以一株抗逆性較強(qiáng)的枯草芽孢桿菌和經(jīng)耐酸耐膽鹽馴化的嗜酸乳桿菌為菌種，主要進(jìn)行了以下幾個(gè)方面的研究：
　　(1)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的一株枯草芽孢桿菌再次篩選，重新分離得到一株對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和青霉菌都具有較好抑菌性的⑤號(hào)菌株；再對(duì)嗜酸乳桿菌進(jìn)行酸馴化和膽

2、鹽馴化，使其具有較強(qiáng)耐酸、耐膽鹽能力。為這兩種菌種應(yīng)用于飼料或飼料添加劑打下了基礎(chǔ)。
　　(2)通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基及條件的優(yōu)化，采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定培養(yǎng)12 h后的枯草芽孢桿菌OD600 nm值的大小比較，以O(shè)D600 nm值大小作為選擇培養(yǎng)基的指標(biāo)。優(yōu)化后的培養(yǎng)基為：碎米水解液6%、酵母粉0.7%、磷酸二氫鉀0.5%，發(fā)酵液OD600 nm值可達(dá)到7.18；并通過單因素試驗(yàn)法確定了培養(yǎng)基的

3、最佳培養(yǎng)條件：初始pH5、培養(yǎng)溫度37℃、接種量6%、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)時(shí)間19 h后收獲菌液，在此最佳條件下OD600 nm值達(dá)到7.38，活菌數(shù)為5.2×1010。
　　(3)選出了可以代替葡萄糖的4%碎米水解糖液作為嗜酸乳桿菌液態(tài)發(fā)酵碳源，再在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上加入增殖因子，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)分析，確定最佳增殖因子組合為A2B1C3，即0.8%乳糖，5%麥芽汁，7%白蘿卜汁。按以上配方液態(tài)發(fā)酵嗜酸乳桿菌的最高O

4、D值（稀釋20倍）可達(dá)到0.463，菌濃度達(dá)6.2×109 cfu/mL。較基礎(chǔ)培養(yǎng)基而言(5.3×108 cfu/mL)，其菌數(shù)也得到大幅度的增長(zhǎng)，為益生菌制劑研制前期（獲得菌體）奠定了基礎(chǔ)。
　　(4)離心收集液態(tài)發(fā)酵的菌體進(jìn)行造粒，米粉、面粉、可溶性淀粉的比例1:1:2，益生菌制粒效果最理想，不僅造粒時(shí)不粘連，而且干燥后的顆粒形狀也完好、結(jié)構(gòu)緊實(shí)；在單因素多水平試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)得出枯草芽孢桿菌最佳保護(hù)劑組合為A3B1C

5、3，即蔗糖溶液濃度為15%，脫脂乳粉5%，甘油濃度15%，存活率75.05%；嗜酸乳桿菌最佳組合是A2B3C1：海藻糖溶液濃度為15%，脫脂乳粉15%，甘油濃度10%，存活率45.46%；復(fù)合益生菌制劑的貯藏性能良好，枯草芽孢桿菌在100天后菌存活率只下降了1.39%；嗜酸乳桿菌下降了25.26%。
　　(5)確定了固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的原料及配比，在此基礎(chǔ)上再逐一選出最佳外加碳源及其濃度與最佳外加氮源及其濃度，此時(shí)枯草芽孢桿菌芽孢數(shù)能