過表達ANT1基因誘導血管平滑肌細胞凋亡與Bax-Bcl-2表達的關系研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 冠心病介入術后再狹窄發(fā)病率高，成為介入手術晚期失敗的主要原因。再狹窄的發(fā)生主要原因是新生內膜形成和血管重塑，其中平滑肌細胞凋亡與增殖的失衡在新生內膜形成中發(fā)揮關鍵作用[1]。參與平滑肌細胞凋亡的調節(jié)因子眾多，調節(jié)機制也存在多條途徑。主要有線粒體介導的信號通路，死亡受體介導的信號通路等。線粒體是細胞能量代謝的中心，并且在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。在細胞接受凋亡刺激后，引起線粒體膜通透性增高，線粒體膜

2、電位降低，繼而釋放凋亡相關蛋白，如細胞色素C(CytC)、凋亡誘導因子(AIF)等，釋放的CytC與凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1)結合，活化半胱氨酸蛋白水解酶(caspase) 9,進而激活caspase 3 途徑，從而導致細胞凋亡。
　　 腺嘌呤核苷酸轉位酶是定位于線粒體內膜的轉運蛋白之一,屬于物種進化中的保守區(qū)域,是細胞凋亡調節(jié)的關鍵基因[2]，研究表明ANT1誘導凋亡作用與線粒體滲透性轉換復合孔(mitochondri

3、Alpermeability transition pore MPTP)有關[3]，可能作為MPTP的一個必要成分，或是與MPTP的主要成分之一-----親環(huán)素D（Cyclophilin D)相互作用[4]，從而引起線粒體膜電位降低，觸發(fā)線粒體途徑的細胞凋亡。細胞實驗證實ANT1可以誘導心肌細胞及腫瘤細胞的凋亡，在體實驗中可以減小腫瘤瘤體體積[5，6]。
　　 因而，本研究通過構建ANT1腺病毒載體，分別用攜帶ANT1基因的GF

4、P 標記的腺病毒及空載體腺病毒轉染體外培養(yǎng)的血管平滑肌細胞，檢測ANT1的表達，進而對過表達ANT1的平滑肌細胞進行凋亡檢測及增殖活性檢測，并分別提取各組細胞的mRNA和蛋白，檢測其中Bax/Bcl-2的表達。從而評價其對平滑肌細胞凋亡的誘導作用及作用機制，以此為作用靶點，可能為支架術后再狹窄等有關平滑肌細胞增殖與凋亡失衡疾病提供了新的治療途徑。
　　 實驗方法：
　　 1、構建攜帶ANT1基因的GFP 標記的重組腺病毒

5、表達載體。采用分子克隆技術，重組穿梭質粒pShuttle-GFP-CMV-ANT1和pShuttle-GFP-CMV，與pAdxSi載體酶切后連接，采用脂質體轉染法轉染人胚腎HEK293細胞，包裝產(chǎn)生ANT1腺病毒顆粒，RT-PCR 鑒定為ANT1重組復制缺陷腺病毒后進行大量擴增。
　　 2、組織塊法體外培養(yǎng)原代大鼠血管平滑肌細胞，用α-actin 進行鑒定。以Ad-ANT1或Ad-GFP 病毒轉染VSMCs，觀察不同時間的轉染

6、效率。并通過RT-PCR及Western Blotting 方法檢測各組細胞ANT1mRNA及蛋白的表達水平。
　　 3、以Ad-ANT1或Ad-GFP 病毒轉染VSMCs，分別檢測細胞凋亡和細胞增殖：
　　 利用激光共聚焦觀察Hochest 染色凋亡細胞核，流式細胞術及TUNEL 法檢測細胞凋亡率，激光共聚焦觀察TMRE 法檢測線粒體膜電位改變。細胞計數(shù)法及CCK8 法檢測細胞的增殖活性。
　　 4、轉染后分別

7、取各組細胞，利用RT-PCR及Western Blotting 方法檢測各組Bax/Bcl-2的mRNA及蛋白的表達水平。
　　 結果：
　　 1、經(jīng)細胞形態(tài)學和α-actin免疫細胞化學方法鑒定，應用組織塊法原代培養(yǎng)所得細胞即為VSMCs?？梢杂糜诤罄m(xù)實驗。
　　 2、成功構建并擴增了Ad-ANT1和Ad-GFP(空載體對照)腺病毒，病毒滴度測定為2×1011pfu/ml。最佳感染復數(shù)MOI為80-100，分別

8、用ANT1腺病毒載體及空載體腺病毒轉染VSMCs后，轉染效率高約80-90％，RT-PCR及 Western Blotting 顯示于空載體轉染組相比較，前者ANT1mRNA及蛋白的表達水平均顯著增高?？梢杂糜诤罄m(xù)實驗。
　　 3、細胞凋亡檢測結果：形態(tài)學檢測：激光共聚焦觀察Hoechst 染色后，Ad-ANT1轉染組細胞染色質邊聚，細胞核不規(guī)則，固縮，或碎裂等明顯細胞凋亡表現(xiàn)。
　　 空載體組細胞核無顯著性改變。TMR

9、E 法檢測細胞線粒體膜電位，Ad-ANT1轉染組細胞出現(xiàn)線粒體膜電位下降或消失，空載體轉染組無顯著性改變。TUNEL及流式細胞術顯示Ad-ANT1轉染組細胞凋亡特征明顯，然后計數(shù)凋亡細胞，與空載體轉染組相比較有顯著性差異。
　　 4、細胞增殖活性檢測結果：經(jīng)細胞計數(shù)及CCK8 法檢測，與空載體轉染組相比較，Ad-ANT1轉染組細胞增殖活性顯著降低。
　　 5、RT-PCR及 Western Blotting 檢測Ad-A

10、NT1轉染組Bax的mRNA及蛋白表達水平增高,與空載體轉染組相比較有顯著差異。Bcl-2 mRNA及蛋白的表達水平兩組間無顯著差異。
　　 結論：
　　 1、成功構建了ANT1的腺病毒過表達載體，并且在體外培養(yǎng)的血管平滑肌細胞中有效表達。
　　 2、過表達ANT1腺病毒組能明顯抑制細胞增殖活性，誘導血管平滑肌細胞出現(xiàn)凋亡。
　　 3、過表達ANT1腺病毒載體，誘導血管平滑肌細胞凋亡的可能機制，是通過上調