水稻白葉枯病原菌TAL效應(yīng)因子激活宿主基因轉(zhuǎn)錄的分子機理研究.pdf

1、黃單胞桿菌可以侵染多種作物。它可以通過引起植物葉片的枯萎，莖和果實的潰瘍、流膿而使作物減產(chǎn)。黃單胞桿菌在侵染過程中會分泌多種毒力因子到宿主細(xì)胞中幫助感病。水稻白葉枯菌是一種革蘭氏陰性黃單胞桿菌，是引起水稻病害的主要病原菌。白葉枯菌通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的轉(zhuǎn)錄激活類效應(yīng)子(transcription activator-like effectors,TALEs)招募水稻轉(zhuǎn)錄因子IIA(transcription factor IIA，TFI

2、IA)的γ亞基(TFIIAγ5)，從而激活宿主感病相關(guān)基因(susceptibility gene，S gene)的表達(dá)。但TALEs究竟如何與TFIIAγ5互作并不清楚。TFIIAγ5需要與TFIIAα、TFIIAβ組成三元復(fù)合物來行使功能。然而TALEs是否招募TFIIAα或者TFIIAβ或者同時招募二者并不清楚。TALEs激活宿主感病相關(guān)基因表達(dá)的機理也需要進(jìn)一步的研究。
　　本論文的研究結(jié)果顯示，在病原菌致病的過程中，TA

3、LEs并不招募水稻TFIIA(α+β+γ/αβ+γ)三元復(fù)合物。但TALEs可以招募TFIIA(α+γ)二元復(fù)合物，形成TALEs+α+的三元復(fù)合物。這種招募通過TALEs的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域(transcription factor binding，TFB)完成。本論文鑒定出TALEs負(fù)責(zé)招募TFIIA(α+γ)二元復(fù)合物的TFB區(qū)域包含72個氨基酸(PthXo1效應(yīng)因子的1044-1115位)。TFB+α+γ復(fù)合物具有TFIIA三元復(fù)

4、合物α+β+γ類似活性，即與TATA-box結(jié)合蛋白(TATA-box binding protein，TBP)互作，從而穩(wěn)定TBP與TATA-box的結(jié)合。TALEs+α+γ異源三元復(fù)合物保留了TALEs結(jié)合DNA的能力。因此，本論文提出了TALEs調(diào)控宿主感病相關(guān)基因表達(dá)的新機理，TALEs可能通過TFB區(qū)域替代并模擬了TFIIAβ亞基的功能從而實現(xiàn)對宿主感病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活。此外，我們還發(fā)現(xiàn)對侵染不同植物的黃單胞桿菌的多種TAL

5、Es的TFB區(qū)域序列高度保守。同時也對植物中的TFIIAγs進(jìn)行了序列保守性分析，發(fā)現(xiàn)其也高度保守。因此，黃單胞桿菌TALEs通過TFB區(qū)域替代水稻中TFIIAβ亞基的致病機制在其他物種中可能也存在。
　　本研究試圖通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法解析TFB+TFIIAα+TFIIAγ或者TFB+TFIIAγ復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而揭示黃單胞桿菌TALEs與宿主中TFIIA的作用機制。經(jīng)過400個克隆的構(gòu)建和520多種蛋白表達(dá)檢測，我們摸索出了

6、純化TFB+TFIIAα+TFIIAγ復(fù)合物以及TFB+TFIIAγ復(fù)合物的方法。通過凝膠層析實驗分析，結(jié)果顯示TFB+TFIIAγ復(fù)合物為高聚狀態(tài)，均一性差，性質(zhì)不穩(wěn)定易沉淀。而TFB+TFIIAα+TFIIAγ復(fù)合物性質(zhì)均一，不多聚，可能更接近行使功能時的生理狀態(tài)。本研究對這兩種復(fù)合物進(jìn)行了約20000個結(jié)晶條件的晶體篩選，但暫時沒有得到晶體。我們通過突變和互作實驗鑒定了部分TFIIAγ中可能與TFB互作的氨基酸。與此同時，本研究解