rAAV2-1-Acrp30對(duì)GK大鼠大血管病變的影響及機(jī)理研究.pdf

1、第一部分rAAV2/1-Acrp30病毒的獲得與純化 目的：將大鼠脂聯(lián)素(Acrp30)基因克隆到腺相關(guān)病毒(AAV)載體中，經(jīng)包裝、純化后獲得rAAV2/1-Acrp30病毒。 方法：根據(jù)GonBank基因序列NM_144744，設(shè)計(jì)相應(yīng)特異性引物，上游引入EcoR Ⅰ位點(diǎn)，下游引入Sal Ⅰ位點(diǎn)，從脂肪組織中抽取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR后，擴(kuò)增Acrp30目的基

2、因。使用EcoR Ⅰ與Sal Ⅰ酶切病毒載體質(zhì)粒pSNAV，回收酶切后的載體片段和PCR產(chǎn)物，T4 DNA連接酶16℃過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆獲得pSNAV-Acrp30，EcoR Ⅰ/Sal雙酶切鑒定，并行測(cè)序。轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，G418篩選培養(yǎng)，獲得抗藥克隆細(xì)胞株。HSV1-rc/ΔML2感染，包裝此細(xì)胞株并收獲病毒載體rAAV2/1-Acrp30。行DNA點(diǎn)雜交法測(cè)定病毒滴度，SDS-PAGE分析判斷病

3、毒純度。 結(jié)果： ①PCR電泳及酶切鑒定表明，pSNAV-Acrp30重組成功，基因測(cè)序顯示裝入pSNAV質(zhì)粒中的Acrp30基因正確。 ②rAAV2/1-Acrp30病毒的大致滴度為1.0×1012μg/ml，分泌蛋白濃度為50ng/ml，重組AAV2/1病毒純度很高。 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)獲得的脂聯(lián)素病毒載體滴度高、感染性好，可以滿足GK大鼠脂聯(lián)素基因治療的實(shí)驗(yàn)研究需要。 第二部分rAAV2/1-Acr

4、p30在大鼠體內(nèi)表達(dá)的比較研究 目的：觀察通過不同途徑、不同劑量注射脂聯(lián)素重組腺相關(guān)病毒(rAAV2/1-Acrp30)在大鼠體內(nèi)表達(dá)效率的比較研究。 方法：分別將3種劑量rAAV2/1-Acrp30通過皮下注射、腹腔注射、肌肉注射2月齡Wistar大鼠。21天后，處死動(dòng)物，取主動(dòng)脈、肌肉、肝臟、脂肪組織及血清，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和原位雜交比較不同途徑、不同劑量方法，血清脂聯(lián)素及主動(dòng)脈、肌肉、肝臟、脂肪組織局部的脂聯(lián)素

5、表達(dá)差異，確定脂聯(lián)素基因治療的最佳途徑和劑量。 結(jié)果：皮下注射、腹腔注射rAAV2/1-Acrp30與肌肉注射rAAV2/1-Acrp30相比，脂聯(lián)素基因在主動(dòng)脈、肌肉、肝臟的表達(dá)明顯低于肌肉注射的對(duì)照組，并與rAAV2/1-Acrp30呈劑量.濃度依賴性，但在不同途徑、不同劑量注射rAAV2/1-Acrp30，血清脂聯(lián)素?zé)o變化。 結(jié)論：肌肉注射rAAV1-Acrp30可能是脂聯(lián)素基因治療最佳途徑，1×1011v.g/m

6、l或以上可能是脂聯(lián)素基因治療最佳劑量。 第三部分糖尿病大鼠主動(dòng)脈硬化模型的構(gòu)建 目的：建立自發(fā)糖尿病(GK)大鼠主動(dòng)脈硬化動(dòng)物模型。 方法：88只雄性GK大鼠隨機(jī)分為正常GK對(duì)照組、建模組，每組44只，期間觀察大鼠一般情況變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，8周后，測(cè)定各組動(dòng)物體重、尿量、空腹血糖、餐后2小時(shí)血糖、胰島素、血清脂聯(lián)素、糖化血紅蛋白、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度酯蛋白(LDL-C)、高密度酯蛋白(HDL

7、-C)，同時(shí)隨機(jī)取主動(dòng)脈用光鏡及電鏡觀察主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)及病理改變。 結(jié)果：與正常GK對(duì)照組比較，模型組大鼠體重增加緩慢，尿量、空腹血糖、餐后2小時(shí)血糖、胰島素、糖化血紅蛋白、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇明顯升高，血清脂聯(lián)素、高密度酯蛋白膽固醇降低。電鏡下主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)觀察顯示：正常GK對(duì)照組主動(dòng)脈硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未見小脂滴空泡，各種細(xì)胞器存在，內(nèi)彈力膜存在，中層平滑肌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無脂滴空泡。模型組出現(xiàn)主動(dòng)脈肥大，內(nèi)皮細(xì)