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文檔簡介
1、第一部分 DOCK5-/-小鼠的引進、繁育及子代基因型鑒定
目的:獲取DOCK5敲除模型小鼠并順利繁殖和鑒定,為深入研究DOCK5基因的功能奠定基礎。
方法:聯(lián)系加大拿蒙特利爾臨床研究所(IRCM)細胞骨架的組織和細胞遷移研究室并同意惠贈DOCK5敲除模型小鼠,委托國內專業(yè)科研單位代理小鼠的進口事務并將小鼠運輸至本單位動物實驗中心喂養(yǎng)和繁殖,并觀察小鼠繁殖情況及表型變化。根據(jù)孟德爾遺傳定律進行繁殖得到不同基因型的子代
2、小鼠,利用PCR技術對子代小鼠進行基因型鑒定。
結果:引進DOCK5+/-小鼠6只,小鼠繁殖及生育順利,符合孟德爾遺傳定律。探索得到適宜的DOCK5鑒定PCR擴增條件,順利進行DOCK5敲除小鼠的基因型鑒定。
結論:DOCK5敲除小鼠引進、飼養(yǎng)及繁殖順利,成功建立敲除鼠的鑒定PCR技術,能夠得到來源穩(wěn)定的動物模型,可用于后續(xù)的相關研究。
第二部分 DOCK5對糖代謝影響的體內研究
目的:探討高脂飲
3、食誘導下DOCK5敲除對小鼠胰島素抵抗及糖代謝的影響。
方法:以C57BL/6J背景的DOCK5+/+小鼠和DOCK5-/-小鼠為研究對象,隨機分為4組:DOCK5+/+小鼠普通飼料喂養(yǎng)組(SD-DOCK5+/+組, n=30)、DOCK5+/+小鼠高脂飼料喂養(yǎng)組(HFD-DOCK5+/+組, n=30)、DOCK5-/-小鼠普通飼料喂養(yǎng)組(SD-DOCK5-/-組, n=30)、DOCK5-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)組(HFD-D
4、OCK5-/-組, n=30)。利用高脂飲食和基因敲出構建環(huán)境與遺傳雙重因素作用的動物模型,觀察各組小鼠體重、攝食、呼吸商和能量消耗的變化,測定其血糖、胰島素和血脂等生化指標,行葡萄糖耐量試驗、胰島素耐量試驗、丙酮酸耐量試驗以及高胰島素正糖鉗夾和組織糖攝取等實驗,評價機體總體代謝情況、葡萄糖代謝以及胰島素敏感性的變化。
結果:成功構建遺傳與環(huán)境因素相互作用的動物模型。與SD-DOCK5+/+組小鼠相比,SD-DOCK5-/-組
5、小鼠各個指標沒有顯著性變化(P>0.05);HFD-DOCK5+/+組小鼠各個指標呈現(xiàn)出高脂飲食誘導后出現(xiàn)的相應變化。與 HFD-DOCK5+/+組小鼠相比,HFD-DOCK5-/-組小鼠體重、肝重、附睪脂肪重量顯著增高(P<0.05);攝食增加,而呼吸商及能量消耗顯著下降(P<0.01);基礎態(tài)血糖、胰島素、血脂水平顯著升高(P<0.01或P<0.05)。GTT、ITT和PTT結果顯示HFD-DOCK5-/-組小鼠在負荷狀態(tài)下血糖或胰
6、島素水平均顯著高于 HFD-DOCK5+/+組小鼠(P<0.01或P<0.05)。鉗夾穩(wěn)態(tài)時HFD-DOCK5-/-組小鼠GIR和GRd顯著低于HFD-DOCK5+/+組小鼠(P<0.01或P<0.05),HGP顯著增高, HGP抑制率顯著下降( P<0.05)。組織糖攝取的結果顯示, HFD-DOCK5-/-組小鼠肝臟和附睪脂肪的組織糖攝取顯著低于HFD-DOCK5+/+組小鼠(P<0.01),但是兩組小鼠間骨骼肌肉組織的糖攝取沒有變
7、化。
結論:高脂飲食誘導下DOCK5敲除可導致小鼠胰島素抵抗和葡萄糖代謝障礙,與2型糖尿病的發(fā)生存在密切的聯(lián)系。
第三部分DOCK5調控肝臟糖代謝的分子機制研究
目的:觀察DOCK5敲除或抑制表達對肝臟PI3K-Akt途徑及相關糖代謝關鍵信號分子的影響,探討DOCK5參與胰島素抵抗及葡萄糖代謝紊亂的分子機制。
方法:利用QPCR技術分析C57BL/6J小鼠DOCK5 mRNA的組織表達分布。檢測S
8、D-DOCK5+/+組和HFD-DOCK5-/-組小鼠肝臟、肌肉、脂肪DOCK5mRNA和蛋白表達變化。在各組小鼠肝臟組織中檢測IR、IRS1、Akt、GSK3β、PEPCK、G6Pase和PP2A蛋白表達或活性變化。利用DOCK5-shRNA質粒轉染Hepa1-6肝細胞構建DOCK5抑制表達的細胞模型,并在胰島素刺激和/或PP2A抑制劑OKadaic acid處理的情況下檢測細胞的葡萄糖攝取率變化,分析DOCK5抑制表達對 IR、IR
9、S1、Akt、GSK3β、PEPCK和G6Pase蛋白的表達及活性變化,并分析OKadaic acid對上述相關指標的影響。
結果:C57BL/6J小鼠DOCK5 mRNA在體內多種組織均有表達,肝臟的表達量高于脂肪和肌肉組織。DOCK5 mRNA和蛋白在HFD-DOCK5+/+組小鼠肝臟的表達量顯著高于SD-DOCK5+/+組小鼠(P<0.01),組間肌肉和脂肪組織的差異表達沒有統(tǒng)計學意義。與SD-DOCK5+/+組小鼠相比
10、,SD-DOCK5-/-組小鼠肝臟 IR、IRS1、Akt、GSK3β、PEPCK、G6Pase和 PP2A蛋白表達或活性變化沒有差異(P>0.05);HFD-DOCK5+/+組小鼠肝臟各個指標呈現(xiàn)出高脂飲食誘導后的相應變化(P<0.05)。與 HFD-DOCK5+/+組小鼠相比,HFD-DOCK5-/-組小鼠肝臟IR和IRS1蛋白磷酸化水平?jīng)]有差異,Akt、GSK3β和PP2A蛋白磷酸化水平顯著下降(P<0.05),而PEPCK和G6
11、Pase蛋白表達增高(P<0.05)。Hepa1-6肝細胞模型中DOCK5抑制表達可顯著降低胰島素刺激的細胞葡萄糖攝取(P<0.01),PP2A抑制劑可以逆轉這種效應。DOCK5抑制表達可顯著降低PP2A蛋白磷酸化水平(P<0.01),但不影響IR和IRS1蛋白磷酸化水平。DOCK5抑制表達可降低Hepa1-6肝細胞胰島素刺激引起的Akt、GSK3β蛋白磷酸化水平(P<0.05),顯著增加PEPCK和G6Pase蛋白表達量(P<0.01
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